Respuesta humoral a CIMAvax-EGF y supervivencia en NSCLC

Synthesis 

El sistema del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) y sus ligandos se consideran un objetivo atractivo para la inmunoterapia dirigida a tumores de origen epitelial.

En los cánceres de pulmón no microcíticos (NSCLC), entre el 40 y el 80% sobreexpresan EGFR, lo que se ha asociado con mal pronóstico y resistencia a agentes citotóxicos. Esta localización tumoral ha sido seleccionada para el desarrollo de varios ensayos clínicos Fase I/II con la vacuna CIMAvax‑EGF que se basan en la inmunización activa con el factor de crecimiento epidérmico (EGF), uno de los principales ligandos del EGFR. En este trabajo, se evalúan dos esquemas de tratamiento diferentes para demostrar por primera vez que la generación de anticuerpos neutralizantes anti‑EGF en pacientes con NSCLC es capaz de inhibir la activación del EGFR en presencia de este ligando, y se encuentran correlaciones entre la capacidad neutralizante y la magnitud de la respuesta de anticuerpos específicos generados con la vacunación. Adicionalmente, se encontró una relación entre la edad y el beneficio clínico de la vacunación, y se ofrecen datos sobre la relación entre las características de la respuesta de anticuerpos anti‑EGF generados y el beneficio clínico de los pacientes tratados con CIMAvax‑EGF. Al mismo tiempo, se demostró la posibilidad de optimizar el esquema de vacunación previamente utilizado con el fin de lograr una respuesta inmune específica más potente, sin toxicidad relacionada

INTRODUCTION

La vacunación terapéutica para el tratamiento del cáncer depende de la inducción de una respuesta inmune específica frente a antígenos asociados al tumor y se considera actualmente como una de las estrategias más prometedoras para la terapia de esta enfermedad (Geldmacher y cols. 2011). El estudio de los mecanismos de acción de las vacunas en el control de la proliferación celular es esencial para el desarrollo de estas estrategias terapéuticas, y muchas veces requiere la evaluación inicial de la capacidad de diferentes esquemas de tratamiento para inducir respuestas específicas contra moléculas propias implicadas en la regulación y la replicación celular.

Desde sus inicios, la vacunología se ha basado en la inmunización mediante el uso de antígenos extraños. Esto ha limitado en gran medida el conocimiento sobre la reactividad del sistema inmune frente a moléculas propias, lo que ha sesgado los experimentos de autoinmunización básicamente hacia el campo de las enfermedades autoinmunes. Sin embargo, existen evidencias experimentales que sostienen la existencia de una reactividad por parte del sistema inmune hacia moléculas propias. Entre las evidencias que sustentan esta teoría se encuentran:

la presencia de autoanticuerpos naturales (Avrameas et al., 1981) y células T autorreactivas (Cohen 1986) en individuos sanos, el descubrimiento de la selección positiva para la generación del repertorio de células T por péptidos propios a nivel del timo (Nikolic-Zugic y Bevan 1990), y la existencia de un sistema inmune funcional en animales mantenidos en un ambiente libre de patógenos (Pereira et al. 1986).

Estas evidencias apoyan la teoría de la existencia de un homúnculo inmunológico, que se basa en la creencia de que la autoimunidad natural no ocurre de forma aleatoria, sino que podría estar dirigida hacia una subpoblación particular de autoantígenos (Cohen y Young 1991; Cohen 1992). Por tanto, en su definición, el homúnculo inmunológico no es más que el término aplicado al repertorio autoinmune natural dirigido contra los antígenos dominantes, el cual está compuesto por células T y B capaces de reconocer epítopos dominantes de lo propio (Cohen y Young 1991). Estas células autoinmunes están reguladas por redes celulares, que incluyen interacciones idiotipo/anti-idiotipo.

EGF es reconocido por anticuerpos naturales en sujetos sanos, se expresa en el timo y, cuando se acompaña de señales secundarias (adyuvantes y proteínas transportadoras), activa una respuesta inmune más eficiente contra él, la cual se incrementa con la supresión de la regulación del sistema inmune (González et al. 2002). Por todas estas características, este factor de crecimiento puede considerarse un componente del homúnculo inmunológico.

EGF es uno de los principales ligandos del receptor del factor de crecimiento epidérmico

(EGFR). La unión de EGF a la región extracelular del EGFR induce la dimerización del receptor que resulta en su autofosforilación y en la transmisión de señales mitogénicas (Prigent y Lemoine 1992; Prenzel et al. 2001). La sobreactivación y/o sobreexpresión del EGFR puede inducir la alteración de diversas funciones biológicas, como la proliferación celular, la migración, la diferenciación y la apoptosis, que en última instancia conducen a la transformación de una célula normal en maligna. Existen múltiples evidencias sobre el valor pronóstico de la expresión de EGFR en cáncer de mama, pulmón, colon, estómago y próstata (Pérez et al. 1984; Macías et al. 1987; Salomon et al. 1995). De hecho, varios estudios en cáncer gástrico que han examinado la expresión concurrente de EGFR y sus ligandos (Yonemura et al., 1992; Tokunaga et al. 1995; Nicholson et al. 2001) reportaron desventajas importantes en los tiempos de supervivencia o en la supervivencia libre de enfermedad cuando existía coexpresión de EGFR y sus ligandos EGF o factor de crecimiento transformador α (TGFα) “Factor de transformación”).

El sistema EGF/EGFR es un blanco muy atractivo para el desarrollo de nuevas

terapias dirigidas al tratamiento del cáncer (Arteaga 2003). Entre las estrategias más conocidas de bloqueo del sistema EGF/EGFR se encuentran el bloqueo directo del receptor mediante anticuerpos monoclonales (mAbs) que se unen específicamente al dominio extracelular de la molécula (DEC) (Barker et al. 2001, Norman 2001), así como el uso de compuestos de bajo peso molecular con actividad de tirosina quinasa del receptor, que compiten por el sitio de unión del ATP (Crombet et al. 2004).

La inmunoterapia activa contra EGF es un concepto emergente, en el que se propone

manipular la respuesta inmune del individuo para generar anticuerpos específicos contra EGF, capaces de bloquear la unión ligando/receptor y, en consecuencia, la señalización a través de este último. Sobre la base de este concepto se generó la vacuna terapéutica CIMAvax-EGF, que está formada por un conjugado químico entre el EGF humano recombinante y la proteína P64k de Neisseria menigitidis, mezclada con el adyuvante oleoso Montanide ISA 51 (EGF/P64k/Montanide ISA 51). Tanto en pacientes con cáncer avanzado como en experimentación animal, esta vacuna se ha administrado por vía intramuscular y ha sido capaz de generar respuestas de anticuerpos específicos frente a EGF (González G et al., 1997). La neutralización de EGF mediada por los anticuerpos generados con la vacunación con CIMAvax-EGF podría prevenir la activación del EGFR y detener el ciclo celular de las células tumorales que lo sobreexpresan.

De este modo, pueden desencadenarse otros mecanismos, como la apoptosis y la inhibición de la angiogénesis, que pueden conducir a la destrucción del tumor o, simplemente, a detener su crecimiento. Estos mecanismos no han sido estudiados previamente.

El cáncer de pulmón de células no pequeñas (CPCNP) es una de las enfermedades malignas más frecuentes en todo el mundo, con una tasa de mortalidad muy alta. Solo el 30% de los pacientes pueden ser tratados mediante cirugía. Los tratamientos tradicionales tienen una eficacia modesta en la mayoría de los pacientes (Bunn et al. 2003). Entre el 40 y el 80% de los CPCNP sobreexpresan EGFR (Salomon et al. 1995), lo que se ha asociado con mal pronóstico y resistencia a agentes citotóxicos (Ryan y Chabner 2000). Por estas razones, pacientes con este tipo de tumor han sido seleccionados para el desarrollo de varios ensayos clínicos de fase I/II con la vacuna CIMAvax-EGF. Estos ensayos clínicos han mostrado que la vacuna es inmunogénica y bien tolerada. También se ha observado un aumento en la supervivencia de aquellos pacientes que alcanzan una alta respuesta de anticuerpos específicos frente a EGF (González et al. 2003). Por otra parte, una publicación de 2006 demostró que dosis mayores de EGF son bien toleradas y que existe una relación entre las dosis, el título de anticuerpos y la supervivencia de los pacientes vacunados (Ramos et al. 2006). No obstante, el mecanismo de acción y la potenciación de la respuesta inmune humoral específica, así como la relación entre el efecto biológico de los anticuerpos específicos generados por la vacunación y el beneficio clínico de los pacientes tratados, no han sido evaluados en profundidad en estudios previos.

Sobre la base de los antecedentes descritos arriba, se formuló la siguiente hipótesis de trabajo:

• Los anticuerpos específicos generados por la vacunación con CIMAvax-EGF en combinación
• con quimioterapia, en dos esquemas de tratamiento diferentes, reducen la concentración de EGF en el suero de pacientes con CPCNP e interfieren con la activación de EGFR promovida por este ligando.

Para demostrar esta hipótesis se plantearon los siguientes objetivos:

• Evaluar la inmunogenicidad de la vacuna CIMAvax-EGF y su efecto sobre las concentraciones de EGF en suero de pacientes con NSCLC tratados con diferentes esquemas de inmunización.
• Evaluar la capacidad de los anticuerpos anti-EGF para prevenir la activación de EGFR.

Evaluar la relación entre las características de la respuesta inmune humoral específica generada y la supervivencia de los pacientes tratados con diferentes esquemas de tratamiento.

• Para alcanzar estos objetivos, proponemos las siguientes tareas experimentales:
• Determinación del título de anticuerpos específicos frente a EGF humano recombinante

en el suero de pacientes en estadios avanzados de CPCNP (IIIb/IV) inmunizados o no con la vacuna CIMAvax-EGF en dos esquemas de tratamiento: quimioterapia/vacuna/vacuna (QVV) y vacuna/quimioterapia/vacuna (VQV).

• Determinación de la respuesta de anticuerpos específicos frente a diferentes regiones de la molécula de EGF.
• Determinación de la concentración de EGF en suero de los pacientes en evaluación.
• Determinación del porcentaje de inhibición de la unión de EGF a su receptor in vitro como medida de la capacidad neutralizante de los anticuerpos generados por la vacunación.
• Determinación del porcentaje de inhibición de la fosforilación de EGFR, inducida in vitro por EGF, causada por sueros de pacientes.
• Evaluación de la supervivencia de los pacientes incluidos en el estudio y de su correlación con las variables inmunológicas estudiadas.

La novedad científica de este trabajo es que, por primera vez, se demuestra en pacientes con CPCNP tratados con la vacuna CIMAvax-EGF la capacidad de los anticuerpos anti-EGF generados para neutralizar EGF y prevenir la fosforilación de EGFR mediada por dicho ligando, y la relación directa de esta capacidad neutralizante con la magnitud de los títulos de anticuerpos específicos dirigidos al lazo B de la molécula de EGF. Adicionalmente, se demuestra que es posible generar una respuesta inmune específica anti-EGF más potente con el esquema de tratamiento VQV que con el esquema QVV.

La contribución al conocimiento consiste en la demostración de que la respuesta inmune humoral específica generada por la vacuna CIMAvax-EGF puede interferir con la proliferación celular regulada asociada a la interacción entre EGF y su receptor. De este modo se respalda la actividad antitumoral de la inmunoterapia activa basada en EGF observada con el uso de los dos esquemas de tratamiento actuales.

El valor práctico de los resultados consiste en respaldar el uso de la vacuna CIMAvax-EGF como alternativa terapéutica para el tratamiento de tumores epiteliales dependientes de EGF para su proliferación y en demostrar la posibilidad de optimizar el esquema de vacunación previamente utilizado con el fin de lograr una respuesta inmune específica más potente.

Los resultados presentes han sido presentados en once eventos nacionales e internacionales; entre ellos, los Talleres Internacionales de Inmunoterapia IT-2006 e IT-2008 (La Habana) y los congresos EORTC 2006 (Praga, República Checa) y EACR20 2007 (Lyon, Francia); forman parte de tres publicaciones en revistas internacionales de alto índice de impacto (“Journal of Clinical Oncology”, “Clinical Cancer Research” y “Journal of Immunotherapy”) y están avalados por el Premio de la Academia de Ciencias de Cuba en el año 2008. Forman parte del registro de la vacuna CIMAvax-EGF en Cuba y en Perú.

REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA

Carcinoma de células no pequeñas: tratamiento y supervivencia

La gran mayoría de los cánceres de pulmón son carcinomas, es decir, tumores malignos que se originan a partir de células epiteliales. Existen dos formas de carcinoma pulmonar, categorizadas según el tamaño y la apariencia de las células malignas observadas histopatológicamente al microscopio: tumores no microcíticos (80.4%) y tumores de células pequeñas (16.8%) (Travis 1995). Esta clasificación se basa en criterios histológicos y tiene importantes implicaciones para el tratamiento y el pronóstico de la enfermedad (2008).

El carcinoma no microcítico (NSCLC) representa más del 75% de todas las neoplasias que se originan en el pulmón, la mayoría de las cuales se presenta en estadio localmente avanzado o metastásico al diagnóstico (Jemal et al 2003; Jemal et al 2005).

La cirugía es la opción terapéutica con intención curativa, pero solo un tercio de los casos al momento del diagnóstico tiene un estadio localizado que permite dicho tratamiento (Esteban et al 2006). A pesar del esfuerzo quirúrgico, muchos pacientes desarrollan recurrencia local o a distancia debido a lesiones no detectables al momento de la cirugía (Mountain 1997).

Los alentadores resultados obtenidos en el tratamiento del carcinoma de células pequeñas de pulmón con quimioterapia a mediados de los años 80 dirigieron la atención hacia el tratamiento del carcinoma no microcítico basado en esta modalidad terapéutica. Desde entonces se han observado avances modestos en términos de supervivencia; no obstante, en general la tasa de respuesta es menor que la del carcinoma de células pequeñas.

Una respuesta completa se observa raramente y solo en el 40% de los pacientes puede alcanzarse una respuesta parcial con las quimioterapias actuales (Silvestri y Spiro 2006).

La cisplatino (CDDP), o su análogo carboplatino, son los agentes quimioterapéuticos que se emplean con mayor frecuencia para tratar el NSCLC (Murray et al 2006). En el NSCLC en estado avanzado, la tasa de respuesta obtenida con los primeros regímenes quimioterápicos con sales de platino fue generalmente baja (10 a 15%), con solo 6 semanas de extensión en la supervivencia media (Group 1995).

Más tarde, en la década de los 90, se desarrollaron nuevos fármacos para el manejo del NSCLC, incluyendo docetaxel, paclitaxel, vinorelbina y gemcitabina. Esto dio lugar a la realización de un gran número de ensayos clínicos que evaluaron estos agentes en monoterapia o en combinación con cisplatino o carboplatino. Estos estudios de combinación mostraron una mejora significativa en la eficacia del tratamiento del NSCLC (Kelly et al 2001, Scagliotti et al. cols. 2002). Con la introducción de estos nuevos agentes ha sido posible ampliar la ventaja en supervivencia en los pacientes en un periodo de 3 a 4 meses en comparación con el tratamiento paliativo solo. Los resultados del tratamiento con al menos 4 ciclos de quimioterapia basados en las combinaciones actuales ofrecen una supervivencia media de 7.8 a 8.1 meses frente a 4 a 5 meses cuando solo se ofrece tratamiento de soporte, con una supervivencia al año del 31 al 36% frente al 18% obtenida sin quimioterapia (Schiller et al 2002).

La mielosupresión, es decir, la reducción en la producción de la línea granulocítica de los leucocitos, es el único efecto adverso que limita la dosificación de estos fármacos (Katzung 2007). Actualmente, la investigación continúa en estudios clínicos sobre la mejor manera de utilizar esta combinación de fármacos (Morera 2004). Por otro lado, la principal ventaja que presentan las quimioterapias modernas está relacionada con un mejor perfil de toxicidad que incluye: menor incidencia de náuseas, vómitos, pérdida de cabello y sepsis por neutropenia febril.

La quimioterapia se considera actualmente el tratamiento estándar para el cáncer de pulmón seguida de la resección con intención curativa y se mantiene el debate sobre la utilidad del tratamiento adyuvante en las primeras etapas (Ia y Ib); aunque existe evidencia clara que favorece su uso en los estadios resecables II y IIIa (Esteban et al 2006). Sin embargo, en la práctica clínica diaria hay pocos datos disponibles sobre el tratamiento de pacientes con carcinoma de pulmón no microcítico (Zietemann y Duell 2010).

2.1.3 Terapia biológica en el tratamiento del cáncer de pulmón Dado el éxito modesto obtenido con la aplicación de las terapias estándar en el tratamiento del cáncer de pulmón, la comunidad científica ha dirigido sus estudios hacia nuevos esquemas terapéuticos para el manejo de esta enfermedad. La terapia biológica o inmunoterapia es una de las nuevas estrategias utilizadas para el tratamiento del cáncer de pulmón. Estas terapias biológicas emplean el sistema inmune, ya sea de forma directa o indirecta, para combatir el cáncer o para reducir los efectos secundarios que pueden causar algunos tratamientos (2010 c). La inmunoterapia puede indicarse en conjunto con cirugía, quimioterapia y radioterapia.

Algunos de los compuestos más utilizados en esta modalidad terapéutica en la actualidad incluyen:

interferones, inhibidores de factores de crecimiento, anticuerpos monoclonales, vacunas terapéuticas, terapia génica y agentes inmunomoduladores no específicos (2010 b).

El desarrollo de la inmunoterapia basada en dianas moleculares específicas presentes en las células tumorales se debe en gran parte al avance en los últimos años en la comprensión de la biología tumoral y de los mecanismos oncogenéticos del cáncer de pulmón.

Algunas de estas dianas moleculares incluyen el factor de crecimiento vascular y sus receptores, así como el receptor del factor de crecimiento epidérmico (Provencio et al 2010). Los agentes empleados para este tipo de tratamiento parecen ser, en general, más seguros y efectivos en ciertos subtipos histológicos de cáncer de pulmón, particularmente en el de células no pequeñas y en sus estadios avanzados (Rossi A 2010). El único inconveniente hasta ahora es que requieren un diagnóstico histológico adecuado del cáncer.

EGF y su receptor como diana de terapias antitumorales.

Factores de crecimiento:

Los factores de crecimiento son un grupo de polipéptidos multifuncionales que participan en una variedad de procesos fisiológicos, incluyendo la embriogénesis, la diferenciación y proliferación celular, la angiogénesis y la activación del sistema inmunitario (Klagsbrun 1990).

Los distintos factores de crecimiento se han agrupado en varias familias, en función de su estructura y de su actividad biológica. Entre estas familias se incluyen la familia del factor de crecimiento epidérmico (EGF), la familia del factor de crecimiento de los fibroblastos (FGF), la del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) y la familia del factor de crecimiento similar a la insulina (ILGF), entre otras.

La familia del EGF está formada, a su vez, por varios factores de crecimiento. La unión de estos factores de crecimiento a sus respectivos receptores da lugar a la activación de una tirosina quinasa asociada a un dominio citoplasmático. Este hecho desencadena una serie de sucesos biológicos y enzimáticos que, en última instancia, conducen a la síntesis de ADN y a la proliferación celular.

La familia EGF: 

Esta familia de ligandos agrupa proteínas relacionadas estructural y funcionalmente que se unen a los receptores ErbB y los activan. La base de esta relación estructural es el denominado dominio tipo EGF, una secuencia de 45 a 50 aminoácidos que contiene 6 cisteínas repartidas de forma específica y unidas entre sí por 3 puentes disulfuro intramoleculares, lo que determina una estructura terciaria compacta de tres capas. Existe abundante evidencia de que esta estructura es responsable de la unión de estos ligandos a sus receptores y de que regiones discontinuas de éstos están implicadas en dicho reconocimiento (Todaro et al., 1980).

Entre los miembros de este grupo, además de su ligando natural, el EGF, encontramos el factor de crecimiento transformante alfa (TGF, del inglés, “transforming growth factor α”) (Todaro y cols. 1976), la amphiregulin (Shoyab et al 1989), el factor de crecimiento ligado a heparina (HB-EGF, del inglés, “heparin-binding growth factor”) (Higashiyama et al., 1991), la betacelulina (BTC) (Ciccodicola et al 1989) y la epiregulina (Groenen et al 1994). Otros ligandos de la familia EGFR descritos a continuación son las neuregulinas o heregulinas (Harari et al 1999) y la tomorregulina (Kinugasa et al 2004).

La mayoría de los ligandos de esta familia se sintetizan como precursores de membrana que constan de la estructura tipo EGF en el dominio extracelular, una extensión amino-terminal, una región transmembrana y una cola citoplasmática. Los ligandos se liberan como factores solubles desde la superficie por una escisión proteolítica en el dominio extracelular; este evento representa una estrategia importante y eficiente para regular la actividad de diversas proteínas de membrana (Dong y Wiley 2000).

El EGF

El EGF fue aislado en 1962 de las glándulas submaxilares de ratón y, posteriormente, en 1975 se obtuvo la forma humana de EGF a partir de orina humana (Cohen et al 1975; Starkey y cols. 1975). El descubrimiento de este factor de crecimiento condujo a la búsqueda e identificación de su receptor celular (EGFR) y a la detección y caracterización de otros miembros de la familia.

El EGF es un polipéptido de 53 aminoácidos con un peso molecular de 6045 Da, y 6 residuos conservados de cisteína que forman tres enlaces covalentes por puentes disulfuro, lo que sugiere que es una molécula estructuralmente estable. La secuencia del EGF también contiene un número relativamente elevado de residuos de glicina y tirosina (Cohen et al 1975; Gregory 1975). Es una molécula de distribución ubicua y, como otros factores de crecimiento y a diferencia de las hormonas clásicas, su producción parece ser sistémica y su acción paracrina (Carpenter et al.1975).

El precursor del EGF (pro-EGF) se distingue por su gran tamaño (1200 aminoácidos) y sus ocho secuencias “tipo EGF” en el dominio extracelular, cualquiera de las cuales puede funcionar como ligando para el EGFR (Gray et al., 1983).

El EGF está presente en el plasma a concentraciones muy bajas y, por lo general, se asocia con las plaquetas y otros elementos de la coagulación sanguínea (Savage et al 1986). En humanos se han encontrado niveles elevados de EGF en el líquido prostático, seminal y cefalorraquídeo, así como en una amplia gama de células epiteliales como pulmón, estómago, riñones, duodeno, páncreas, piel, mama, glándulas salivales, tiroides, ovario, útero y placenta. Además, se ha señalado que el hígado puede ser una fuente de EGF circulante (Laborde et al 1988).

Aunque no se conocen con exactitud todas las funciones del EGF, una gran variedad de efectos en mamíferos, tanto en animales experimentales como en cultivos celulares, se han atribuido a este factor. Entre estos efectos se incluyen: apertura temprana de los párpados y aparición de los dientes en ratones recién nacidos, estimulación in vitro de células normales y tumorales de origen ectodérmico y mesodérmico (Carpenter y Cohen 1990), así como el desarrollo y maduración de otros órganos como los pulmones, el tracto gastrointestinal, la glándula mamaria, entre otros. Además, favorece la angiogénesis, inhibe la secreción gástrica ácida y se ha demostrado que acelera la cicatrización de heridas (Schultz et al.cols. 1991).

Todos los miembros de la superfamília del EGF se unen al EGFR u a otro miembro de la familia de receptores del EGF con actividad tirosina quinasa, pero exhiben actividades biológicas diferentes

Receptor de EGF: el EGFR

El EGFR pertenece a una familia de receptores con actividad tirosina quinasa que traducen la información de los factores de crecimiento extracelulares hacia vías de señalización intracelular. Estas señales, a su vez, modulan diversas funciones biológicas, tales como la proliferación, migración, diferenciación y apoptosis celular (Holbro y Hynes 2004). Esta familia, también conocida como la familia ErbB, consta de cuatro receptores: el EGFR o Her1 / ErbB1 (que fue el primero en ser clonado) (Ullrich et al 1984), Her2 / neu / ErbB2, Her3 / ErbB3 y Her4 / ErbB4 (Normanno et al., 2005).

Los receptores de la familia ErbB presentan una estructura modular que consiste en un dominio extracelular de unión a ligando, un dominio transmembrana hidrofóbico y un dominio intracelular. Este último tiene una porción citoplásmica muy conservada a lo largo de la evolución, con actividad tirosina quinasa, con la excepción de Her3, que presenta sustituciones de aminoácidos críticas y carece de actividad quinasa. Los dominios extracelulares son los menos conservados en la familia, lo que sugiere que distintos receptores tienen diferentes especificidades en la unión a sus ligandos. Los receptores con frecuencia se coexpresan en las células y, dependiendo del ligando activador, pueden formar homodímeros o heterodímeros, lo que genera una compleja red de transducción de señales (Alroy y Yarden 1997, Riese y Stern 1998).

Estructura del EGFR 

El EGFR es una glicoproteína transmembrana con un peso molecular de 170 kDa, cuya cadena polipeptídica consta de 1186 aminoácidos, y contiene 40 kDa de oligosacáridos unidos a residuos de asparagina en 11 o 12 sitios potenciales de glicosilación (Ullrich et al. 1984; Stroop et al. 2000). El EGFR está formado por un dominio extracelular de unión al ligando de 621 aminoácidos, un dominio transmembrana simple de hélices alfa hidrofóbicas de 23 aminoácidos y un dominio intracelular de 542 aminoácidos (Ullrich and Schlessinger 1990).

El dominio extracelular del EGFR tiene un peso molecular de 105 kDa, y su conformación en el espacio es independiente del resto de la molécula. Se compone de cuatro subdominios denominados I (L1), II (S1), III (L2) y IV (S2). De estos, el subdominio II contiene la región crítica para que ocurra la dimerización entre los receptores, y ha sido denominado “brazo de dimerización” (Garrett et al 2002, Ogiso et al 2002).

El dominio intracelular comprende tres subdominios: el subdominio yuxtamembrana, que es necesario para la retroalimentación mediada por la proteína quinasa C; la cola carboxi-terminal, que carece de actividad catalítica y presenta seis tirosinas que son sitios de transfosforilación y de unión de proteínas adaptadoras y/o efectoras como Grb2 y fosfolipasa Cγ, respectivamente; y el subdominio central con actividad tirosina-quinasa (Src), que corresponde al subdominio de homología 1 (SH1), responsable de la transfosforilación de las seis tirosinas en la región carboxi-terminal (Bazley and Gullick 2005). Se ha observado que las tirosinas fosforiladas en el EGFR aparecen tras la activación dependiente del ligando (Sweeney and Carraway 2000) y que el patrón de fosforilación determina el tipo de segundo mensajero que será reclutado (van der Geer and Pawson 1995).

Activación del EGFR y transducción de señales

Se postula que la unión de un monómero de TGF- o EGF al dominio extracelular del EGFR estabiliza una conformación que permite la homodimerización o heterodimerización con otros miembros de la familia EGFR. La unión del ligando a los subdominios I y III provoca reordenamientos espaciales que exponen el subdominio II o “brazo de dimerización” de la molécula. La dimerización permite la autofosforilación cruzada en residuos tirosina que sirven como sitios de reclutamiento y anclaje de proteínas con dominios homólogos tipo Src 2 (SH2, del inglés “Src homology 2”) (Koch et al., 1991) o dominios de unión a fosfotirosina (PTB, del inglés “phospho-tyrosine-binding”) (Garrett et al., 2003) que inician múltiples vías de señalización intracelular.

La red de señales transmitidas a través del EGFR es extremadamente compleja. La diversidad de ligandos, junto con la posibilidad de formar combinaciones de homodímeros y heterodímeros en la familia ErbB, y su acoplamiento a diversas vías de señalización intracelular, determinan este alto grado de complejidad en el llamado sistema EGF/EGFR. Existen tres vías fundamentales de señalización a través del sistema EGF/EGFR. La primera de estas vías de señalización es la denominada vía de las quinasas activadas por mitógenos (MAPKs, del inglés “mitogen-activated protein kinases”). Esta vía es posiblemente la más estudiada de las señalizaciones intracelulares asociadas con el sistema EGF/EGFR. Los efectos biológicos observados tras la activación por ligandos del EGFR podrían asociarse a la activación de la vía Ras/Raf/ERK. Cuando la activación es mediada por EGF, estos efectos están fundamentalmente asociados con la proliferación celular (Di Fiore PP 1987).

Otra vía de señalización intracelular del EGFR activado está asociada con la fosfatidilinositol 3-quinasa (PI3K, del inglés “phosphatidylinositol-3 kinase”), que estimula señales antiapoptóticas mediadas por el factor nuclear de transcripción  (NF-B, del inglés “nuclear factor-B”) y señales de división celular. Por lo tanto, la activación de la vía PI3K mediada por el EGFR se relaciona directamente con la supervivencia de las células tumorales.

Una tercera vía de señalización ocurre a través de c-Src, una tirosina-quinasa citoplasmática implicada en numerosos procesos celulares, incluidas señales mitogénicas (Prenzel et al 2001). La familia de factores de transcripción y transductores de señales 3 (STAT3, del inglés “signal transducer and activator of transcription 3”) se activa mediante esta proteína, y tiene una importancia particular en la proliferación y supervivencia de las células tumorales (Rubin Grandis et al. 1998). Un miembro de esta familia, STAT3, regula la producción del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF, por sus siglas en inglés), el cual incrementa la proliferación celular y está estrechamente ligado a fenómenos de angiogénesis en tumores (Niu et al 2002).

Todas las vías de señalización intracelular activadas a través de los receptores ErbB convergen en el núcleo, donde los reguladores del ciclo celular y los factores de transcripción controlan la respuesta biológica a la activación de dichos receptores.

EGFR y cáncer 

Los efectos oncogénicos relacionados con la alteración de la fisiología del EGFR han convertido

al sistema EGF/EGFR en un objetivo muy atractivo y prometedor para la intervención

inmunoterapéutica basada en agentes antagonistas específicos del EGFR. El EGFR constituye una proteína ampliamente expresada en los tejidos del organismo, y se considera un antígeno asociado a tumores (TAA, del inglés, “tumor associated antigen”).

La primera línea de pensamiento que sugiere que el EGFR está implicado en la patogénesis de los carcinomas humanos se deriva de un gran número de estudios que han mostrado la sobreexpresión de esta proteína en la mayoría de los tumores sólidos de origen epitelial. El EGFR presenta una expresión aumentada en tumores de pulmón (Hendler y Ozanne 1984), mama (Pérez et al 1984), cabeza y cuello (Dassonville et al 1993), colon (Lockhart y Berlin 2005), esófago, próstata (Liu et al 1993, Zhau et al 1996), vejiga (Neal et al 1985), páncreas (Tan et al. 2004), ovario (Gullick et al 1986) y tumores cerebrales (Salomon et al 1995). La frecuencia de expresión del EGFR en tumores de origen epitelial es, por lo general, alta. Por ejemplo, en el caso de los carcinomas de cabeza y cuello, el EGFR se expresa en el 100% de los casos estudiados, y en el carcinoma de pulmón no microcítico esta frecuencia es aproximadamente del 80% (Normanno et al., 2003). La sobreexpresión del EGFR por las células tumorales se debe a diversos mecanismos, que incluyen amplificación génica, alteración de eventos transcripcionales, así como deleciones o mutaciones que generan receptores constitutivamente activos (Nicholson et al., 2001).

Los efectos oncogénicos relacionados con la alteración de la fisiología del EGFR han convertido al sistema EGF/EGFR en un objetivo muy atractivo y prometedor para la intervención inmunoterapéutica basada en agentes antagonistas específicos del EGFR. El EGFR constituye una proteína ampliamente expresada en los tejidos del organismo, y se considera un antígeno asociado a tumores (TAA, del inglés, “tumor associated antigen”).

La primera línea de pensamiento que sugiere que el EGFR está implicado en la patogénesis de los carcinomas humanos se deriva de un gran número de estudios que han mostrado la sobreexpresión de esta proteína en la mayoría de los tumores sólidos de origen epitelial. El EGFR presenta una expresión aumentada en tumores de pulmón (Hendler y Ozanne 1984), mama (Pérez et al 1984), cabeza y cuello (Dassonville et al 1993), colon (Lockhart y Berlin 2005), esófago, próstata (Liu et al 1993, Zhau et al 1996), vejiga (Neal et al 1985), páncreas (Tan et al. 2004), ovario (Gullick et al 1986) y tumores cerebrales (Salomon et al 1995). La frecuencia de expresión del EGFR en tumores de origen epitelial es, por lo general, alta. Por ejemplo, en el caso de los carcinomas de cabeza y cuello, el EGFR se expresa en el 100% de los casos estudiados, y en el carcinoma de pulmón no microcítico esta frecuencia es aproximadamente del 80% (Normanno et al., 2003). La sobreexpresión del EGFR por las células tumorales se debe a diversos mecanismos, que incluyen amplificación génica, alteración de eventos transcripcionales, así como deleciones o mutaciones que generan receptores constitutivamente activos (Nicholson et al., 2001).

Además, la sobreexpresión del EGFR se asocia con mal pronóstico en tumores de cabeza y cuello y pulmón (Brabender et al 2001; Khademi et al 2002), con un alto riesgo de recurrencia de la enfermedad (Chow et al 1997, Turkeri et al 1998) y con disminución de la supervivencia en pacientes con cáncer de ovario, colon, vejiga, tiroides y cabeza y cuello (Akslen et al 1993; Fischer-Colbrie et al 1997; Grandis et al 1998). Además, numerosos estudios muestran que la presencia de niveles elevados de EGFR se correlaciona directamente con resistencia a las terapias convencionales (Holbro et al 2003).

Los tumores que poseen activación constitutiva del EGFR tienden a ser más agresivos en cuanto a la formación de metástasis. Existe evidencia en la literatura de que la sobreexpresión de EGFR conduce a un aumento de la capacidad metastásica de las células tumorales en algunos modelos, y que esto se debe a un incremento en su capacidad de intravasación (Xue et al., 2006). Además, se ha encontrado que muchos tipos de células tumorales migran por activación autocrina estimulada por EGFR (Obeid et al. 1997).

Los factores de crecimiento también desempeñan un papel crucial en el ciclo celular. Algunos de ellos forman parte de los factores de competencia, que conducen a las células de la fase G0 a las fases iniciales de G1. El EGF en particular es un factor de progresión del ciclo celular, ya que se encarga de estimular los eventos moleculares necesarios para que ocurra la transición a través del punto de restricción (punto R) ubicado en la fase G1. Una vez superado este punto, las células pueden progresar hacia la fase G2, y desde aquí continuar a las siguientes fases del ciclo incluso en ausencia de factores de crecimiento. Por esa razón, la presencia de estímulos excesivos provoca una progresión continua del ciclo y la consiguiente división celular, lo que conduce a una proliferación descontrolada de células. Este es el caso en las células tumorales, que además se vuelven independientes de estos estímulos mediante el aumento de la expresión de moléculas receptoras de señal, como el EGFR (Lui y Grandis 2002).

Sin embargo, la correlación entre los niveles de expresión del EGFR y la transformación neoplásica in vivo aún es controvertida (Gullick y Srinivasan 1998). Robertson y colaboradores demostraron que entre el 40 y el 60% de las neoplasias examinadas muestran niveles normales de expresión de EGFR (Robertson 1996 KW). En esos casos, los cambios en los ligandos del receptor podrían tener más influencia en la actividad antitumoral que los cambios relacionados con los niveles de expresión del EGFR. No obstante, en la actualidad se sabe que los niveles de expresión de EGFR son muy altos en ciertas neoplasias y constituyen un marcador de mal pronóstico. Por todo lo expuesto, el sistema del EGFR y sus ligandos constituyen actualmente un excelente objetivo para la terapia antitumoral.

Inmunoterapia del cáncer

La mayoría de los pacientes con cáncer son tratados con una combinación de cirugía, quimioterapia y radioterapia. La cirugía por sí sola no es suficiente para la erradicación completa de las células cancerosas. Por otro lado, la radioterapia y la quimioterapia afectan tanto a las células malignas como a las normales, provocando efectos adversos severos. En general, el sistema inmunitario de un paciente no puede suplantar estos tratamientos antitumorales; en su lugar, elimina antígenos que reconoce como no propios, mientras que generalmente ignora aquellos que considera propios. Los tumores están formados por células propias que son malignas y por ello pueden eludir la vigilancia del sistema inmune (Cappuccio et al. 2007).

En los últimos años, el interés en la inmunoterapia del cáncer ha crecido como una vía para aumentar la respuesta del sistema inmunitario frente al tumor. Existen dos estrategias esenciales para la evaluación de nuevos fármacos oncológicos: la inmunoterapia pasiva y la inmunoterapia activa.

Inmunoterapia pasiva y EGFR

La inmunoterapia pasiva se basa en el uso de anticuerpos monoclonales específicos dirigidos al dominio extracelular del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR). La accesibilidad que posee el dominio extracelular del EGFR para anticuerpos e inmunotoxinas, la diferencia de expresión del receptor en la superficie de las células (alta en células tumorales y baja en tejidos epiteliales normales) y la biología del sistema EGFR/ligando han convertido a esta molécula en un objetivo importante para el desarrollo de inmunoterapia pasiva del cáncer de origen epitelial. De hecho, se han producido y caracterizado anticuerpos monoclonales contra el EGFR humano que se unen al receptor con una afinidad similar a la de los ligandos naturales, compiten con ellos e inhiben la activación inducida por el ligando (Kawamoto et al 1983; Sato et al. 1983).

Los efectos derivados del uso de terapias antitumorales con anticuerpos monoclonales contra el EGFR se atribuyen a la interferencia con las interacciones ligando-receptor que resultan en la eliminación del estímulo proliferativo. Estos anticuerpos podrían desempeñar un papel clave en el reclutamiento y la activación de células efectoras citotóxicas, interviniendo en un mecanismo de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) (Bier et al 1998).

Uno de estos anticuerpos con actividad terapéutica es el anticuerpo monoclonal quimérico de isotipo IgG1 ICM-C225 / Cetuximab / Erbitux. Cetuximab se une específicamente a la Subdominio III del dominio extracelular del EGFR, compitiendo con el ligando EGF. Por lo tanto, este anticuerpo bloquea la activación del receptor, afecta el proceso de dimerización e induce una internalización y degradación eficaces del EGFR (Shiqing et al., 2005). También se ha demostrado que puede inducir ADCC mediante la activación de células mononucleares de sangre periférica humana, lo que sugiere otro mecanismo potencial de acción antitumoral de dicho fármaco (Naramura et al 1993). Cetuximab fue el primer anticuerpo bloqueador del EGFR aprobado por la entidad reguladora de fármacos y alimentos en EE. UU. (FDA “US Food and Drug Administration”) para su uso en pacientes. Inicialmente recibió la aprobación para su uso como monoterapia o en combinación con irinotecán en pacientes con carcinoma colorrectal metastásico con expresión detectable de EGFR (Systems-ImClone 2004) y, posteriormente, para su uso en pacientes con carcinomas de células escamosas de cabeza y cuello en combinación con radioterapia. Además, existen estudios clínicos en fase II y III en curso en los que se incluyen pacientes con carcinoma pancreático en estadios avanzados (Xiong y cols. 2004). Para el carcinoma de pulmón no microcítico (NSCLC) (Lynch TJ et al. 2004; Rosell et al. 2004) ya se han completado ensayos de fase III y este producto ha sido registrado en Europa. Aunque la terapia con Cetuximab es tolerable, con frecuencia aparecen efectos adversos asociados al uso del fármaco, como reacciones alérgicas, hipomagnesemia, fatiga y toxicidad cutánea en forma de erupciones (Lacouture 2006). En ocasiones estos efectos adversos pueden ser graves y conducir a una reducción de la dosis o a la suspensión precoz del tratamiento (Tejpar et al 2007, Boland and Bebb 2010). Otro anticuerpo con resultados clínicos alentadores es el anticuerpo monoclonal humanizado h-R3 / TheraCIM / Nimotuzumab. Nimotuzumab, generado en los laboratorios del Centro de Inmunología Molecular, se obtuvo a partir de su predecesor murino, el ior egf / r3, desarrollado mediante inmunización previa de ratones con placenta humana enriquecida con EGFR (Fernández A et al., 1992).

Nimotuzumab, al igual que Cetuximab, es un anticuerpo específico contra el dominio extracelular del EGFR. Nimotuzumab fue registrado en Cuba por el Centro para el Control Estatal de la Calidad de los Medicamentos (CECMED) en 2004 para su uso en pacientes con tumores avanzados de cabeza y cuello en combinación con radioterapia (Crombet et al. 2004). Posteriormente, dicho registro se amplió a otros sitios tumorales, como tumores cerebrales y de esófago. También se encuentran en fases avanzadas los estudios clínicos que respaldan su posible uso en pacientes con tumores de mama, próstata y pulmón, en los cuales se han obtenido resultados alentadores (Crombet et al., 2006).

Otros anticuerpos monoclonales específicos para el EGFR que han obtenido aprobación para su uso en pacientes son ABX-EGF / Panitumumab (Tiseo et al 2004, Amato 2005, Tyagi 2005) y EMD 72 000 / Zalutumumab (Graeven et al., 2006).

Otra estrategia actualmente empleada basada en el bloqueo de la señalización a través del EGFR es la inhibición de la actividad de la tirosina quinasa mediante fármacos de bajo peso molecular: los inhibidores de la tirosina quinasa (TKI, del inglés “tyrosine kinase inhibitors”). Los resultados más prometedores en fase clínica con este tipo de compuestos se han obtenido con análogos del ATP, de las familias de la piridopirimidina y la quinazolina, que actúan bloqueando el sitio de unión al ATP en el dominio quinasa del receptor, inhibiendo su activación. Los estudios iniciales realizados con la quinazolina ZD1839 / IRESSA / Gefitinib mostraron que este fármaco posee actividad antitumoral in vitro e in vivo, tanto en monoterapia como en combinación con terapias convencionales (Ciardiello et al 2000; Sirotnak et al 2000).

Otras estrategias empleadas para inhibir la actividad del EGFR están asociadas al uso de pequeñas moléculas de ARN interferente (siRNA, del inglés “small interfering ribonucleic acid”) (Zhang et al 2004; Kang et al 2006); proteínas de fusión toxina-ligando dirigidas contra el EGFR, mediante la conjugación de EGF o TGF-α a formas truncadas de la exotoxina A de Pseudomonas y otras toxinas celulares menos inmunogénicas (Fitzgerald 1996; Shao et al. 1998; Uckun et al. 1998; Noonberg and Benz 2000).

Inmunoterapia activa

Fundamentos de la inmunoterapia activa específica

La inmunoterapia específica activa ha resurgido con vigor desde finales de la década

1990. Sin embargo, hace más de 100 años, William Coley describió por primera vez la remisión de tumores en pacientes con cáncer tratados con bacterias o sus respectivos extractos (Wiemann y Starnes 1994). Algunos de estos productos bacterianos fueron potentes activadores del sistema inmunitario y, en consecuencia, los tumores fueron destruidos (Krieg y Wagner 2000). A partir de este descubrimiento se ha acumulado mucha evidencia sobre el reconocimiento de

los tumores por el sistema inmune. Se han descubierto y caracterizado muchos antígenos que están sobreexpresados en células malignas en comparación con sus niveles de expresión en células normales. Además, la hipótesis de la vigilancia inmunológica del cáncer, en la que las células presentadoras de antígenos (CPA) reconocen las células transformadas y mutagénicas, permite activar a otros componentes del sistema inmune para eliminarlas (Sahin et al 1995, Kaplan et al 1998). De hecho, el auge en el uso de la inmunoterapia activa específica ha sido motivado por múltiples evidencias científicas que demuestran la existencia de la inmunovigilancia tumoral (Burnet 1970), la posibilidad de definir y caracterizar antígenos asociados al tumor (Ko et al.

2003), y una mejor comprensión de los mecanismos moleculares de procesamiento y presentación de antígenos e inducción de la respuesta inmune. Actualmente se están evaluando en estudios clínicos más de 50

vacunas, y se han realizado más de 400 ensayos clínicos (Lage et al., 2005). Las vacunas contra el cáncer son una aplicación de estos

conocimientos y se basan en el principio de la inducción de una respuesta inmune efectiva para eliminar el tumor.

Debido a que las vacunas contra el cáncer se evaluaron inicialmente en pacientes con tumores avanzados y, por tanto, no pudieron prevenir la enfermedad, se las ha llamado vacunas terapéuticas. En el campo de la inmunoterapia activa, se considera que existen dos generaciones de vacunas contra el cáncer, que actualmente coexisten en diferentes ensayos clínicos: una primera generación basada en preparaciones celulares, conocidas como vacunas celulares, y otra basada en entidades moleculares, denominadas vacunas moleculares.

Las vacunas de primera generación han utilizado células tumorales autólogas irradiadas o

sus extractos como fuente de antígenos tumorales, en combinación con adyuvantes (Mitchell et al 1988, Morton et al 2002). También se han desarrollado vacunas con células tumorales autólogas o heterólogas modificadas químicamente, enzimáticamente o genéticamente (Mach y Dranoff 2000; Berd et al. 2001; Salgia et al. 2003).

El desarrollo de vacunas basadas en antígenos asociados al tumor, que constituyen moléculas propias para las cuales operan en su mayoría los mecanismos de eliminación

central tímica, encuentra su marco teórico en la teoría del daño, postulada por Polly Matzinger (Matzinger 1994). Según esta teoría, la función principal del sistema inmunitario radica en la necesidad de distinguir entre lo dañino y lo inofensivo, en lugar de distinguir entre lo propio y lo no propio. De este modo, la vacunación contra moléculas propias podría ser exitosa si ocurre en un contexto de “señales de peligro”, para lo cual es fundamental el diseño de los adyuvantes.

Por lo tanto, las estrategias de vacunación utilizadas en el tratamiento del cáncer dependerán en gran medida de la calidad del antígeno seleccionado (Berzofsky et al., 2004) y del adyuvante empleado para la activación de la respuesta inmune, conduciendo a una activación eficiente de las CPA y la posterior activación de las células T CD4+ y las células T CD8+ para ejercer sus funciones.

En el campo de la vacunación contra tumores también hay informes recientes que señalan que la diversificación del reconocimiento antigénico que ocurre con algunas estrategias vacunales puede ser beneficiosa para la respuesta antitumoral. Este fenómeno, muy bien descrito en modelos de enfermedades autoinmunes, comienza con la respuesta contra un epítopo antigénico simple. Este epítopo se presenta en el CMH II de las células presentadoras, lo que activa células Th y células T efectoras que causan inflamación crónica y muerte celular blanca. Los desechos celulares, que contienen otros antígenos, son entonces capturados por las células presentadoras y presentados de forma cruzada por el CMH I, con la consiguiente activación de nuevas células T CD8+ específicas para otros epítopos en la misma molécula (diversificación intramolecular) o en otras moléculas (diversificación intermolecular). Existen algunas evidencias experimentales que sostienen este fenómeno. El-Shami y colaboradores publicaron que en ratones vacunados con un péptido de OVA (ovoalbúmina) y desafiados con EG7OVA (línea de timoma EL-4 transfectada con OVA) son capaces de generar una respuesta CTL contra otros antígenos. Esta respuesta mostró protección ante un desafío posterior con EL-4 que no expresa OVA (El-Shami et al 1999). En el caso de estudios en humanos, se ha publicado que pacientes que sobreexpresan el receptor del factor de crecimiento epidérmico tipo 2 (HER-2/neu) en tumores de mama y ovario y que han sido vacunados con péptidos de esta molécula combinados con el factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF), muestran una respuesta inmune contra péptidos no incluidos en la vacuna.

Este tipo de respuesta también se correlaciona con la respuesta antitumoral observada en

pacientes vacunados (Brossart et al 2000).

Debido a la baja inmunogenicidad de las células tumorales y a la definición molecular de los antígenos tumorales, en los años 80 las investigaciones desviaron su atención hacia el uso de entidades moleculares en la terapia activa contra el cáncer (Lage et al., 2005). Una de las estrategias utilizadas en este tipo de vacunas ha sido la inserción de los genes que codifican estos antígenos tumorales en vectores virales recombinantes (Liu 1998) y el uso del ácido nucleico desnudo correspondiente (Polo y Dubensky 1998). Otro tipo de vacuna molecular está constituido por péptidos derivados de varios antígenos tumorales. Entre estos, los más utilizados son los derivados de antígenos de melanoma como MART-1, gp-100, tirosinasa y antígenos de la familia MAGE. La vacunación con estos péptidos ha sido exitosa en la inducción de células T CD8+ específicas, pero la respuesta clínica ha sido variable e ineficaz (Slingluff et al 2003; Akiyama et al 2005). Otras estrategias con vacunas moleculares comprenden el uso de proteínas sintéticas o purificadas del tumor (Naftzger et al 1996). Estas vacunas incluyen aquellas que contienen proteínas de choque térmico (HSP); oncoproteínas mutadas como K-ras y p53; glicoproteínas de la familia de las mucinas como MUC-1; el antígeno carcinoembrionario (CEA), expresado en tumores gastrointestinales; el antígeno prostático específico (PSA), sobreexpresado en el cáncer de próstata, entre otros. En este sentido, se ha realizado un intenso esfuerzo para diseñar vacunas basadas en HSP autólogas derivadas de tumores (Belli et al 2002). Estas proteínas endógenas, altamente conservadas, forman complejos con péptidos tumorales que inducen una respuesta de células T específicas cuando se presentan en las CPA (Rivoltini et al 2003).

Otra estrategia, que ha sido ampliamente utilizada, es la vacunación con células dendríticas (CD) (Nestle et al 2001). Estas células presentadoras capturan, procesan y presentan péptidos a células T vírgenes en los órganos linfoides secundarios. Este proceso, junto con la interacción de moléculas coestimuladoras entre las CD y los linfocitos T, conduce a la activación de estos últimos y la posterior eliminación de las células tumorales que expresan el antígeno. Las CD pueden ser estimuladas con células tumorales autólogas o alogénicas (Celluzzi y Falo 1998), extracto tumoral (Ashley et al 1997, Nair et al 1997) y cuerpos apoptóticos (Chang et al 2002). Además, pueden fusionarse por electroporación con células tumorales irradiadas (Siders et al., 2003). También es posible la incorporación de ADN y ARN exógenos en estas células mediante virus recombinantes, plásmidos o electroporación (Akiyama et al. 2000; Esslinger et al. 2002). La mayoría de estas preparaciones han sido inmunogénicas y han provocado el rechazo tumoral en modelos animales. En el escenario clínico, la vacuna de CD más avanzada es Provenge, también conocida como Sipuleucel-T. Esta vacuna, utilizada en cáncer de próstata avanzado, se basa en CD cargadas ex vivo con una proteína de fusión recombinante que contiene fosfatasa ácida prostática y GM-CSF. Los resultados del ensayo fase III mostraron un aumento significativo en la supervivencia de los pacientes vacunados con respecto al

grupo control que solo recibió placebo, así como una disminución apreciable en los niveles séricos de

PSA (Basler y Groettrup 2007). Esta terapia constituye la primera vacuna terapéutica aprobada por la FDA para el cáncer (Kantoff et al 2010; Madan y Gulley 2011).

El principal beneficio de la inmunoterapia activa específica en el tratamiento del cáncer es la posibilidad de dirigir el ataque del sistema inmune hacia las células tumorales del propio individuo. Esta especificidad las hace más efectivas y probablemente menos tóxicas que otros agentes terapéuticos utilizados hasta ahora.

Por otro lado, a pesar de la experiencia acumulada hasta la fecha en el campo de la inmunoterapia activa específica, es muy común observar la falta de asociación entre la inducción de una respuesta inmune específica y una respuesta clínica favorable en los pacientes. Entre otras causas, ello podría deberse a una baja sensibilidad en las técnicas utilizadas para medir las respuestas generadas, a la incapacidad de medir la respuesta que tiene lugar en el sitio del tumor y/o en órganos linfoides secundarios, o al uso de esquemas de vacunación subóptimos para la generación de una respuesta específica realmente eficaz.

Optimización de estrategias de vacunas

Aunque no existe evidencia sólida en la literatura científica sobre los esquemas óptimos

de tratamiento con vacunas contra el cáncer, los estudios procedentes del campo de las enfermedades

infecciosas sugieren que, en algunos escenarios, la administración de dosis altas de vacunas compuestas por proteínas recombinantes se asocia con una respuesta específica robusta frente al antígeno y un aumento en la frecuencia de individuos respondedores. Este es el caso de una prueba realizada en animales, que fueron inmunizados con diferentes dosis de una vacuna

contra el virus del herpes, obteniéndose respuestas mayores de linfocitos T específicos en aquellos animales inmunizados con la dosis más alta (Martina et al 2003). En otro ensayo realizado en donantes sanos, el grupo que recibió la dosis más alta de una vacuna basada en proteínas recombinantes del virus del papiloma humano (HPV) generó la mayor frecuencia de respondedores entre los sujetos vacunados (de Jong y cols. 2002). Por otra parte, la administración de dosis elevadas de vacuna se asocia con el desarrollo

de una respuesta de memoria tras la vacunación, así como con la generación de anticuerpos de alta avidez frente al antígeno (Kundig et al 1996).

La correcta identificación de adyuvantes efectivos es también un aspecto crítico en el

desarrollo de vacunas antitumorales. Los requisitos de un adyuvante utilizado para el

desarrollo de vacunas terapéuticas para el tratamiento de pacientes con cáncer difieren de los requisitos de los adyuvantes convencionales. En primer lugar, los pacientes que recibirán

la inmunoterapia son pacientes inmunocomprometidos, que presentan mecanismos dañados de

procesamiento y presentación de antígenos, y la inhibición de la reactividad frente a los antígenos controlada por las células T reguladoras está reforzada (O’Garra y Vieira 2004). En segundo lugar, los antígenos tumorales suelen ser propios y, por tanto, relativamente poco

inmunogénicos. Finalmente, los tumores desarrollan mecanismos para evadir al sistema inmunitario,

como, por ejemplo, los mecanismos de edición tumoral, la escasa presencia o ausencia de expresión de moléculas MHC-I, así como la secreción de citocinas o moléculas supresoras (Ko y cols. 2003). Por lo tanto, los adyuvantes de las vacunas para el tratamiento del cáncer no solo deben estimular respuestas contra antígenos poco inmunogénicos, sino también revertir la inmunosupresión inducida por los tumores. Estos adyuvantes deben afrontar diversos desafíos en las distintas etapas de la generación de la inmunidad antitumoral durante la vacunación. De hecho, sus principales funciones dentro de las preparaciones vacunales son: servir como reservorio para liberar lentamente el antígeno en el área de inflamación en la que se reclutan las DCs; madurar las DCs; mediar la presentación cruzada de antígenos acoplados a ellos; modular y polarizar la respuesta inmune, así como activar a los linfocitos T citotóxicos (CTL, del inglés: “cytotoxic T lymphocytes”).

Entre las “señales de peligro” exógenas que han demostrado una excelente capacidad adyuvante

se encuentran el Bacillus Calmette-Guérin (BCG) y el ADN bacteriano no metilado con secuencias CpG (CpG). El BCG se ha utilizado con cierto éxito como agente antitumoral en el

tratamiento del cáncer de vejiga superficial y en melanomas (Alexandroff et al 1999; Soiffer et al. cols. 2003). Por su parte, CpG ha mostrado la capacidad de estimular potentes respuestas

específicas contra varios tipos de tumores en ensayos preclínicos (Brunner et al 2000). Estas

investigaciones preclínicas fueron el precedente para la realización de numerosos ensayos

clínicos que actualmente están en curso utilizando secuencias CpG o BCG

como adyuvantes de vacunas terapéuticas contra el cáncer (Speiser et al., 2005). Otro derivado bacteriano al que se le atribuyen importantes propiedades inmunopotenciadoras y un efecto antitumoral en ensayos preclínicos es la proteína OmpA de la membrana externa de la bacteria Gram-negativa Klebsiella pneumoniae (Jeannin et al 2000). Se ha demostrado la capacidad de todos estos derivados para activar las DCs en diversos escenarios. Por ejemplo, tanto BCG como CpG activan DCs humanas y murinas, promoviendo el aumento en

la expresión de moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) de tipo I y II, de las moléculas CD80 y CD86 y de la secreción de IL-12 (Jakob et al 1998, Goldmann et al 2002). También existen experimentos

realizados con la proteína OmpA recombinante expresada de N. meningitidis, que

muestran su capacidad para inducir la maduración completa de las DCs a través de receptores tipo Toll (TLR) (Jeannin et al 2000).

Las vías de administración utilizadas para la vacunación pueden ser también determinantes

para obtener un efecto óptimo con una preparación vacunal específica. En los esquemas de vacunación contra el cáncer se han utilizado mayoritariamente las vías de inmunización subcutánea o intradérmica. Los resultados derivados de numerosos ensayos realizados en animales, así como algunos estudios clínicos, sugieren que las vías de administración intratumoral o intraganglionar podrían ser las más eficaces. Kudo-Saito y colaboradores, por ejemplo, demostraron que el uso secuencial de una vacuna subcutánea seguido de una estrategia de vacunación intratumoral es más efectivo en términos de efecto antitumoral que el uso de una única vía de inmunización (Kudo-Saito et al., 2005b).

Finalmente, una estrategia que recientemente ha comenzado a aplicarse es la utilización de terapias combinadas dirigidas a obtener respuestas antitumorales efectivas. Para lograr este objetivo deben considerarse terapias que combinen la eliminación de elementos supresores, como las células T reguladoras y las citocinas supresoras; la adición de componentes activos del sistema inmune, como la transferencia adoptiva de células T efectoras, las citocinas estimuladoras y el uso de DCs como presentadoras. Además, deben añadirse moléculas que actúen directamente sobre las células malignas, como aquellas que inhiben la angiogénesis y el crecimiento tumoral.

Vacunas en el tratamiento del cáncer de pulmón de células no pequeñas

Históricamente, el primer intento de tratar el CPCNP mediante inmunoterapia activa ha sido el uso de vacunas celulares autólogas o alogénicas, que se hacen más antigénicas mediante manipulaciones genéticas para expresar moléculas inmunoestimuladoras como GM-CSF.

Este enfoque terapéutico es atractivo porque no requiere el conocimiento previo de un antígeno objetivo a tratar. El uso de estas vacunas ha tenido poco éxito en otras localizaciones como melanoma y cáncer de próstata; sin embargo, una de ellas (Lucanix) ha alcanzado la fase III de desarrollo para el tratamiento del CPCNP (Mellstedt et al., 2011).

Con la identificación de antígenos tumorales expresados por el NSCLC se han desarrollado productos mejor caracterizados para la inmunoterapia activa en el NSCLC, entre los que se encuentran Gvax, LBLP25 o Stimuvax, Belagenpumatucel o Lucanix, la vacuna MAGE-A3, EP2101 (IDM 2101) y la vacuna de células dendríticas (O’Mahony et al 2005; Nemunaitis y Murray 2006; Nemunaitis 2007; Barve et al. 2008; Dy y Adjei 2009; Gerard y Debruyne 2009; Hirschowitz y Yannelli 2009).

Gvax is a vaccine of autologous cells transfected with an adenovirus that has the gene of GM-CSF. This vaccine is specific to each patient and requires a tissue sample individual tumor for its development. Genetic manipulation induces the secretion of cytokines and immunosuppressive proteins at the injection site. It has been investigated in a Phase study I / II of 43 patients with NSCLC (33 with advanced disease). The toxicity profile was satisfactory with local reaction grade 1-2, while the secretion of GM-CSF correlated with the evolution of patients. A problem associated with the use of this vaccine is that it is prepared with own tissue of patients in advanced stage of the disease which can produce a unfavorable delay in the beginning of this therapy.

Belagenpumatucel (Lucanix) is composed of multiple NSCLC cell lines transfected with the growth factor transforming gene β2 (TGF β2) that inhibits cellular expression of TGF β2 making the tumor cells more immunogenic. Lucanix has been studied in open phase II trial in patients with NSCLC stage II, III and IV after the first line of treatment with chemotherapy. In this trial the authors demonstrated that no significant adverse events were presented. Patients in advanced stages who received the higher dose had a higher response rate and advantages in the survival at one and two years when compared with those who received lower doses of treatment. These results allowed the start of a Phase III trial (Nemunaitis et al. 2006).

The Liposomal vaccine MUC 1 (STIMUVAX) (L-BLP25) targets the nucleus of the antigen tumor-associated MUC1.The BLP25 is a lipopeptide of 25 amino acids that gives it the specificity of MUC1 (Mucin 1). MUC1 is a transmembrane protein, which is expressed in secretory epithelial cells and contains large amounts of sugars bound by bonds of O-glycosidic type. It is overexpressed in many types of cancer. The MUC1 associated with tumors is antigenically distinct from that of normal cells (Nemunaitis 2007).

Its expression is associated with reduced apoptosis, immunosuppression, resistance to chemotherapy and limited survival. Stimuvax is a liposomal vaccine that incorporates a lipid adjuvant and three lipids to increase the distribution of the vaccine to cells presenters In a phase II trial (Butts et al., 2005) in patients with stage IIIB / IV NSCLC, after completing the first line of treatment and having submitted a response objective or stabilization of the disease, LBLP25 was administered weekly for weeks at 4 injection sites and with a low dose of cyclophosphamide 3 days before the vaccination. The treatment was tolerable, the most common adverse events were: symptoms flu and reactions at the injection site. The median survival was 17.4 months for the vaccinated group compared to 13 months for the control group. The patients in Stage IIIB were those with the highest survival. These results led to the realization of a Phase III study currently underway.

EP2101 (IDM 2101) is a vaccine generated to induce cytotoxic T lymphocyte response against multiple epitopes and tumor associated antigens. It was designed to induce that response against five antigens frequently overexpressed in NSCLC: carcinoembryonic antigen (CEA), p53 protein (p53), HER-2 / neu and melanoma antigens MAGE 2 and MAGE 3, which have have been studied in trials with previous vaccines (Marshall et al 2000, Brabender et al 2001; Fong et al. 2001). Two previous phase I trials demonstrated the safety and immunogenicity of This vaccine, which is why Phase IIIB / IV patients were included in a Phase II trial.

NSCLC that resulted positive HLA (Barve et al., 2008); no adverse events were found significant, only erythema and mild pain at the injection site. The survival per year was 60% and the median survival was 17 months.

The MAGE A3la vacuna fue diseñada para estimular el sistema inmunitario a responder al antígeno MAGE A3 que fue aislado inicialmente en células de melanoma. Ensayos de fase I en melanoma y NSCLC (Marchand et al. 2003) dieron evidencia de que esta proteína es poco inmunogénica por sí sola, por lo que requiere un sistema adyuvante para inducir una respuesta inmune robusta y sostenida (Atanackovic et al. 2004). Se evaluó en un estudio de fase II controlado con placebo en 182 pacientes, estadios Ib y II de NSCLC tras haber sido resecados y en tumores que expresan MAGE A3. Tras 28 meses de seguimiento, hubo un aumento del 27% en el intervalo libre de enfermedad cuando se comparó con el grupo control.

Los eventos adversos descritos en este ensayo fueron leves (Vansteenkiste et al., 2007). Con estos resultados se diseñó un ensayo multinacional de fase III que aún se encuentra en la fase de reclutamiento de pacientes.

Otras terapias probadas en pacientes con NSCLC son las vacunas basadas en células dendríticas. Las células dendríticas poseen todos los elementos necesarios para iniciar y potenciar una respuesta inmune específica frente a antígenos. Para estas terapias, los precursores de células dendríticas se obtienen por leucaféresis, se cultivan y se administran en forma de vacuna al paciente. En un estudio de fase I, se generaron precursores de células dendríticas CD14 + que fueron cargados con cuerpos apoptóticos de una línea celular de NSCLC que sobreexpresaba Her2/neu, CEA y MAGE-2. De los 16 pacientes en el grupo vacunado, ninguno experimentó eventos adversos graves, demostrando que la vacuna es segura y presentó actividad biológica en 11 de los pacientes evaluados (Hirschowitz y Yannelli 2009). Sin embargo, ensayos posteriores no han mostrado evidencia de efectividad en este tipo de tumor.

Por otra parte, el único estudio clínico relacionado con terapia activa basada en el EGFR y sus ligandos para el tratamiento del NSCLC es la vacunación contra el ligando EGF. Resultados previos de nuestro grupo han mostrado la posibilidad de realizar una inmunoterapia activa contra el cáncer basada en la inmunización con este ligando del EGFR (Rodriguez et al., 2010).Tratamientos combinados de inmunoterapia en el cáncer

La terapia contra el cáncer ha evolucionado hacia la integración estratégica de diferentes modalidades de tratamiento con el objetivo de optimizar las posibilidades de curación. La cirugía y la radioterapia se han utilizado para lograr el control locorregional de la enfermedad, mientras que las terapias sistémicas (quimioterapia, terapia endocrina, terapias dirigidas a dianas moleculares) se han utilizado en el control de la enfermedad difusa (en neoplasias hematológicas) o de la que se ha diseminado más allá del sitio primario (en tumores sólidos) (Emens 2010). Además, con frecuencia se combinan múltiples fármacos con mecanismos de acción complementarios para obtener eficiencias antitumorales aditivas o sinérgicas.

La quimioterapia antineoplásica típicamente altera vías regulatorias fundamentales y esenciales para la supervivencia y el crecimiento de las células tumorales, pero se ve limitada por mecanismos de resistencia al fármaco y por el daño colateral tóxico en tejidos normales.

Recientemente se ha descrito como determinante principal tanto del curso clínico como de la respuesta clínica en tumores malignos la interacción entre el tumor y el huésped (Zitvogel et al. 2008; Formenti 2010; Pages et al. 2010). Entre los elementos de la respuesta del huésped que son críticos para la progresión y el crecimiento tumoral se incluyen:

fibroblastos del estroma, células endoteliales del huésped, macrófagos asociados al tumor, células NK y linfocitos específicos para el tumor. El mecanismo de acción de múltiples fármacos se basa en la manipulación de la interacción entre el tumor y el huésped para favorecer la regresión tumoral. Bevazucimab, Sunitinib y Sorafenib actúan sobre la biología de la célula endotelial de modo que afectan la vasculatura asociada al tumor (Heath y Bicknell 2009).

Algunos anticuerpos monoclonales se unen específicamente a su molécula diana en la célula y provocan el reclutamiento de células efectoras de la inmunidad innata para mediar la citotoxicidad sobre las células tumorales (Weiner et al., 2009).

Por otra parte, las vacunas contra el cáncer pueden inducir activamente respuestas inmunitarias específicas frente a los tumores, tanto humorales como celulares (Finn 2008). Las ventajas de este tipo de inmunoterapia con respecto a las terapias tradicionales se deben a la exquisita especificidad por las células tumorales, con un mínimo de efectos adversos y su potencial para producir efectos duraderos sin requerir terapia activa continua como consecuencia de la memoria inmunológica que se crea.

Al mismo tiempo, la capacidad de ciertas quimioterapias para aumentar la eficacia de las vacunas de células tumorales y de promover la actividad de células T tumorales transferidas adoptivamente ha sido descrita (Baxevanis et al., 2010). Entre los mecanismos propuestos para la potenciación de la respuesta inmune inducida por la quimioterapia se encuentra la inducción de muerte celular, aumentando la presentación cruzada de antígenos tumorales in vivo. Adicionalmente, la mielosupresión inducida por quimioterapia puede inducir la producción de citocinas que favorecen la proliferación homeostática y/o la ablación de mecanismos de inmunosupresión.

Así, la combinación del efecto de las terapias establecidas para el tratamiento del cáncer con los efectos logrados por la inmunoterapia se ha convertido en una estrategia terapéutica que promete ser más efectiva para el tratamiento del cáncer.

En la actualidad, varios ensayos clínicos han abordado estas estrategias combinatorias. Como ejemplos está el uso de anticuerpos contra el antígeno citotóxico expresado en linfocitos T (CTLA-4, antígeno citotóxico de linfocitos T) con los que se bloquea la señal regulatoria negativa dada por esta molécula. En modelos animales, la combinación de este anticuerpo con vacunas de células enteras o vacunas peptídicas resultó en un aumento significativo de la actividad antitumoral de dichos inmunógenos (Davila et al 2003, Hurwitz et al 2003). De manera similar, la combinación de anticuerpos contra las células T reguladoras CD4 + CD25 + con vacunas de células dendríticas es otra de las nuevas estrategias de terapia combinada que incluyen la vacunación, destinada a incrementar la efectividad de la respuesta inmune contra el cáncer (Kudo-Saito et al 2005a, Prasad et al 2005).

En estudios clínicos de fase II en NSCLC avanzado recurrente se observó un aumento en el tiempo hasta la progresión de la enfermedad y en la supervivencia global al combinar el anticuerpo Bevacizumab (Avastin) con regímenes basados en platino (Adjei et al., 2010).

Se han descrito eventos adversos graves, incluida hemorragia pulmonar, en pacientes con carcinoma pulmonar de histología escamosa. Basándose en estos resultados, el estudio de fase III 4599 del ECOG (Eastern Cooperative Oncology Group) combinó Bevacizumab en el mismo tipo de pacientes pero excluyendo la histología escamosa.

Por otra parte, un ensayo de fase II en primera línea de tratamiento combinado con quimioterapia en NSCLC avanzado demostró un aumento en la tasa de respuesta en pacientes tratados con la combinación Figitumumab / quimioterapia comparado con la quimioterapia sola (54% vs 42%) (Karp et al., 2009). Figitumimab (CP-751871) es un anticuerpo monoclonal potente Humanizado que se une selectivamente al receptor del factor de crecimiento similar a la insulina (IGF1R) y evita la unión del factor de crecimiento similar a la insulina tipo I a su receptor y, como consecuencia, inhibe el crecimiento tumoral (Cohen et al., 2005).

La vacuna Oncophage, compuesta por HSP96 a la que están complejados péptidos tumorales, es un ejemplo del uso de este tipo de terapia, específicamente en pacientes con carcinoma renal en estadio IV. Los resultados de un ensayo clínico de fase III ya concluido mostraron un aumento en el intervalo libre de enfermedad en el grupo de pacientes tratados con la combinación de cirugía, vacuna e IL-2 en comparación con el grupo tratado con cirugía e IL-2 (Belli et al 2002).

La inmunoterapia basada en EGFR también ha sido objeto de combinaciones terapéuticas. En el caso de cetuximab, se ha demostrado que aumenta la sensibilidad a la quimioterapia tanto in vitro como en humanos (Kim et al., 2009). Cetuximab se ha estudiado en varios ensayos clínicos en combinación con quimioterapia en primera y segunda línea. Los resultados del estudio multicéntrico de fase I/II de cetuximab en combinación con paclitaxel y carboplatino en pacientes con NSCLC en estadio IV demostraron que el tratamiento era seguro y bien tolerado, y se observaron tasas de respuesta, tiempo hasta la progresión y supervivencia media ligeramente superiores a controles históricos tratados solo con carboplatino y paclitaxel (Thienelt et al. 2005). Posteriormente, los autores del estudio de fase III denominado FLEX indicaron que la adición de cetuximab al régimen quimioterápico con cisplatino/vinorelbina en primera línea produjo un aumento modesto de la supervivencia global con un incremento de la respuesta en pacientes con NSCLC avanzado que expresan EGFR (Pirker et al., 2009; Stinchcombe y Socinski 2009). El principal evento adverso que este anticuerpo produce es erupción cutánea (rash) de grado 2-3.

Con todo este conocimiento, el potencial para maximizar la actividad biológica y mejorar el perfil clínico de las inmunoterapias nunca ha sido mayor. La integración estratégica de la inmunoterapia con las quimioterapias para transformar el microambiente tumoral y reducir diferentes mecanismos de supresión y tolerancia inmunológica podría sostener una respuesta inmunitaria antitumoral vigorosa y sostenida. Elegir cuidadosamente las dosis y los tiempos de administración de los fármacos en la interacción con la inmunoterapia, emplear modelos de laboratorio relevantes para la clínica y realizar ensayos clínicos piloto permitirá acelerar el desarrollo de ensayos clínicos en fases superiores para convertir la quimioinmunoterapia en una realidad clínicamente significativa (Emens 2010).

Vacuna CIMAvax-EGF

La inducción de una deficiencia de EGF como consecuencia de una inmunoterapia activa ha sido un concepto emergente desarrollado por científicos cubanos en el Centro de Estudios de Inmunología Molecular desde 1992. Este concepto implica la manipulación del sistema inmunitario del individuo para producir anticuerpos contra la molécula EGF con el objetivo de prevenir la progresión tumoral (Pérez et al 1984; Macias et al 1987; González et al 1996; Arteaga 2003; Lage et al. 2003; González y Lage 2007).

CIMAvax-EGF es una vacuna terapéutica contra el cáncer basada en la conjugación del EGF humano recombinante a una proteína transportadora (P64k de Neisseria meningitidis) que ha sido desarrollada completamente en Cuba. Resultados previos de nuestro grupo han mostrado la posibilidad de realizar una inmunoterapia activa contra el cáncer con la vacuna basada en EGF. De hecho, se han obtenido evidencias tanto preclínicas como clínicas sobre su inmunogenicidad y baja toxicidad (González et al 1996).

Estudios preclínicos

Los estudios preclínicos para el desarrollo de la formulación más eficaz en la inducción de la respuesta inmune frente al EGF autólogo comenzaron a principios de los años 90. Inicialmente se evaluó la posibilidad del reconocimiento del propio EGF en ratones y monos (González et al 1996). Los ratones produjeron anticuerpos contra el EGF murino cuando fueron inmunizados con EGF unido a la proteína portadora. Los anticuerpos producidos mostraron memoria inmunológica de isotipo IgG. En los monos se observó la producción de anticuerpos anti-EGF cuando fueron vacunados con EGF humano conjugado a la proteína transportadora. También se mostró que la inmunización con EGF modifica la biodistribución del EGF inyectado en ratones (González et al 1996).

Adicionalmente, se realizaron 7 estudios en animales para mejorar la inmunogenicidad de la vacuna de EGF humano recombinante con diferentes proteínas transportadoras y determinar la mejor formulación. Las proteínas transportadoras estudiadas fueron: toxoide tetánico, la P64k de Neisseria meningitidis, T3 (anticuerpo monoclonal murino que reconoce CD3 humano) y B7 (anticuerpo monoclonal murino que reconoce células B humanas). Los adyuvantes estudiados fueron: adyuvante de Freund incompleto y completo (AIF / ACF), alúmina y Montanide ISA 51 (adyuvante oleoso producido por SEPPIC, Francia). También se estudiaron diferentes vías de administración, distintos esquemas y tratamientos combinados con quimioterapia y/o inmunosupresión (González G et al 1997; González et al. 2002).

Todos los experimentos demostraron que la inmunización con EGF unido a una proteína transportadora en un adyuvante apropiado genera una respuesta de anticuerpos anti-EGF que tiene un efecto antitumoral en animales experimentales. Además, no se observaron daños histológicos en ninguno de los animales tratados (González et al 1996).

Ensayos clínicos

El desarrollo clínico de CIMAvax-EGF comenzó en 1995 con un ensayo fase I/II (Piloto I) realizado en el hospital CIMEQ en La Habana. En este ensayo se incluyeron 10 pacientes con malignidades primarias en diferentes localizaciones, que habían recibido previamente la primera línea de quimioterapia. El objetivo principal de este estudio fue la evaluación de la inmunogenicidad de la formulación inicial de la vacuna (González et al., 1998). El resultado de este ensayo constituyó la primera evidencia científica publicada sobre la posibilidad de inducir una respuesta inmune frente al EGF autólogo en pacientes con tumores en estadio avanzado. Adicionalmente, se confirmó el uso de la proteína P64k como el inmunopotenciador adecuado para la conjugación y formulación de la vacuna CIMAvax-EGF.

Un factor clave en el desarrollo de la formulación final de la vacuna fue la selección de la localización tumoral apropiada para la introducción de esta estrategia vacunal novedosa. Se seleccionó el NSCLC porque es una patología muy frecuente y por la alta expresión de EGFR en tejidos tumorales durante el desarrollo y la progresión de las neoplasias pulmonares (Lage et al. cols. 2003; González y Lage 2007). La magnitud de la expresión de EGFR ha sido reportada en la Literatura como factor predictivo de respuesta a terapias biológicas en pacientes con NSCLC (Toffoli et al., 2007).

Los ensayos clínicos publicados siguientes coincidieron en el tiempo (Piloto II, 1997-1999 y Piloto III, 1998-2001) y también fueron ensayos fase I/II desarrollados en hospitales de la ciudad de La Habana. El ensayo Piloto II incluyó 20 pacientes con NSCLC en estadios avanzados (IIIb y IV). Diez de los pacientes incluidos recibieron la vacuna con el adyuvante alúmina y los otros 10 recibieron la vacuna con el adyuvante Montanide ISA 51 (González et al 2003). El ensayo Piloto III también incluyó 20 pacientes con las mismas características que el Piloto II, pero esta vez ambos grupos de tratamiento recibieron ciclofosfamida (200 mg / m2 de superficie corporal) 72 horas antes de comenzar la vacunación (González et al 2003). La ciclofosfamida ha sido ampliamente estudiada en el tratamiento del cáncer. Sus efectos inmunomoduladores tienen repercusiones distintas según la dosis y el esquema terapéutico utilizado (Man et al 2002; Ghiringhelli et al 2004). Este tratamiento previo a la vacunación se introdujo con el objetivo de interferir en la tolerancia inmunológica al EGF y potenciar la inducción de inmunogenicidad frente a esta molécula propia desde la primera dosis (González et al 2003).

Ambos ensayos clínicos confirmaron la inducción de una respuesta inmune humoral específica frente al EGF y permitieron clasificar a los pacientes inmunizados en dos subgrupos: malos respondedores (MR) y buenos respondedores (BR) de acuerdo con la magnitud de la respuesta de anticuerpos anti-EGF generada y la seroconversión de la respuesta inicial.

En ambos estudios la supervivencia fue mayor para el grupo BR (media: 12.41 meses; mediana: 9.1 meses) que para el grupo MR (media: 5.47 meses, mediana: 4.5 meses). La diferencia en supervivencia entre estos dos subgrupos de pacientes fue estadísticamente significativa (Log rank; p <0.05). Adicionalmente, en estos estudios se observó una mayor inmunogenicidad cuando se utilizó el adyuvante Montanide ISA 51 en la formulación de la vacuna, así como los beneficios del tratamiento con dosis bajas de ciclofosfamida 72 horas antes de iniciar la vacunación (González et al 2003, González et al 2007).

Finalmente, en el período 2000-2003 se desarrolló un cuarto ensayo clínico, fase I/II (Piloto IV) con el objetivo de evaluar dos niveles de dosis distintos y superiores a los usados en las pruebas previas. Cuarenta y tres pacientes con NSCLC en estadios avanzados (IIIb y IV) fueron aleatorizados en dos grupos para recibir 71 μg o 142 μg de EGF. La dosis menor se administró en una de las regiones deltoideas y la mayor se distribuyó entre ambas regiones deltoideas (Ramos et al 2006). Los pacientes tratados mostraron supervivencias superiores (media: 9.83 meses, mediana: 8 meses) a las de un control histórico de pacientes con iguales características demográficas (media: 6.2 meses, mediana: 4.1 meses).

Variables inmunofarmacológicas en la optimización del esquema de vacunación

La inmunofarmacología de las vacunas contra el cáncer aún no se comprende completamente y existen datos muy limitados sobre los determinantes inmunofarmacológicos que influyen en las vacunas terapéuticas para el tratamiento del cáncer (Starzl and Zinkernagel 1998; Zinkernagel and Hengartner 2001; Couch et al. 2003; Berd et al. 2004; Lage et al. 2005; Aucouturier et al. 2006; Gardiner et al. 2006). Variables como la dosis, la vía de administración, el intervalo de administración de las dosis y las combinaciones óptimas con terapias establecidas deben evaluarse en mayor profundidad. Este proceso es aún más complejo cuando se trata de optimizar un esquema basado en la generación de anticuerpos contra una molécula propia, con la intención de eliminar dicha molécula circulante y prevenir su interacción con su receptor en las células tumorales (Rodriguez et al., 2010).

Para hacer la inmunización más eficiente con la vacuna CIMAvax-EGF, los investigadores volvieron a la experimentación preclínica con la hipótesis de generar una respuesta inmune más potente, capaz de mantenerse por un largo periodo tras sucesivas inmunizaciones. Con este fin inmunizaron animales de diferentes antecedentes genéticos (ratones BALB/c y C57BL/6) con la vacuna CIMAvax-EGF (EGF / P64k / Montanide ISA 51) y evaluaron distintas dosis, número de inmunizaciones e intervalos de dosis, tanto durante la fase de inducción como durante la fase de re-inmunización. De este modo lograron inducir una respuesta de anticuerpos anti-EGF temprana, robusta y de larga duración (Rodriguez et al. 2008). Para el periodo de activación, la fraccionación de la dosis y la administración intramuscular en 4 sitios anatómicamente diferentes aumentaron los títulos de anticuerpos y extendieron la duración de la respuesta. También se demostró que las re-inmunizaciones repetidas convertían a los MR en BR. Los resultados de estos estudios condujeron a la conclusión de que la vacunación debe administrarse en dosis fraccionadas altas en sitios anatómicamente diferentes para llevar la vacuna a los ganglios linfáticos regionales y lograr sinergia en la respuesta inmune (Rodriguez et al., 2008).

Entre otras vacunas diseñadas para el tratamiento del cáncer de pulmón, la vacuna CIMAvax-EGF es la única vacuna en el mundo que induce títulos de anticuerpos anti-EGF que neutralizan al EGF endógeno, eliminando este importante factor de crecimiento del tumor (Hirschowitz and Yannelli 2009).

Los resultados de seguridad e inmunogenicidad obtenidos con el uso de la vacuna contra el EGF en el cáncer constituyen un estímulo para futuras investigaciones y para el desarrollo de nuevos esquemas terapéuticos en la inmunoterapia del cáncer.

MATERIALES Y MÉTODOS

Componentes de la vacuna CIMAvax-EGF

• El factor de crecimiento epidérmico humano recombinante (EGF) fue producido en el Centro de Ingeniería Genética y Biotecnología (CIGB, La Habana, Cuba) mediante tecnología de ADN. Se expresa en Sacaromise sereviciae y está compuesto por una mezcla de EGF de 51 y 52 aminoácidos. Esta molécula no glicosilada ha mostrado una actividad biológica equivalente a la de la molécula completa de 53 aminoácidos (Calnan et al. 2000).
• La proteína P64k de Neisseria meningitidis también fue producida en el CIGB, La Habana, Cuba. Es una proteína recombinante que se expresa en Escherichia coli, contiene 599 residuos de aminoácidos incluyendo 7 residuos de cisteína (Raúl Gómez 1999).
• Montanide ISA 51 (Seppic, France) fue el adyuvante utilizado en la preparación de la vacuna. Es un adyuvante listo para su uso y debe mezclarse 50/50 (v / v) con la fase antígena acuosa.

Preparation

La vacuna está compuesta por factor de crecimiento epidérmico humano recombinante (EGF) conjugado a la proteína recombinante P64k de Neisseria meningitidis como proteína transportadora para la conjugación; se añadió glutaraldehído al 0,05% a la mezcla proteica y la reacción se mantuvo durante una hora, bajo agitación constante y a temperatura ambiente (25 ° C). Luego el conjugado fue dializado y filtrado bajo condiciones estériles. El conjugado final contenía dos moléculas de EGF por molécula de P64k (González G et al., 1997; et al. 1998).

Todos los procedimientos se llevaron a cabo en cumplimiento con las Buenas Prácticas de Manufactura. Se utilizó Montanide ISA51 como adyuvante, el cual se mezcló hasta la emulsificación con igual volumen de la vacuna EGF, inmediatamente antes de la inyección.

Pacientes y Metodología

Selección de pacientes

Ensayo fase II

Se incluyeron pacientes con diagnóstico confirmado por técnicas cito-histológicas de cáncer de pulmón no microcítico en estadios IIIb-IV con lesiones evaluables según los criterios para la evaluación de la respuesta al tratamiento en tumores sólidos (RECIST, “Response Evaluation Criteria in Solid Tumors”). Todos los pacientes habían recibido el último ciclo de quimioterapia al menos 4 semanas antes de la vacunación y tenían una expectativa de vida mayor a 3 meses. Los criterios de inclusión restantes se listan a continuación:

• Pacientes con lesiones evaluables, definidas como aquellas que pueden medirse con exactitud en al menos una dimensión (se refiere al diámetro mayor) y poseen un diámetro igual o mayor a 20 mm usando técnicas convencionales (TAC, PET, RMN o radiografía) o un diámetro mayor o igual a 10 mm usando TC helicoidal.
• Age > 18 años
• Estado general según ECOG < 2 (Karnofsky > 60%)
• Pacientes que presenten función orgánica y médula ósea definidas por los siguientes parámetros:
• Hemoglobin > 9 g / L
• Leukocytes > 3000 / uL
• Recuento absoluto de neutrófilos > 1500 / uL
• Recuento de plaquetas > 100000 / uL
• Bilirrubina total: Dentro de los límites normales
• Transaminasa glutámico-pirúvica (TGP) y transaminasa glutámico-oxalacética (TGO) <5 veces el límite superior de la normalidad institucional
• Creatinina: Dentro de los límites normales para cada institución
• Pacientes femeninas en edad fértil deben tener una prueba de embarazo negativa y emplear métodos anticonceptivos tales como dispositivos intrauterinos, anticonceptivos hormonales, métodos de barrera o ligadura de trompas
• Pacientes que hayan firmado el consentimiento informado

Resultados del ensayo clínico

En ambos ensayos se cumplieron los siguientes criterios para la salida definitiva del protocolo de estudio:

RESULTS

Evaluación de la respuesta de anticuerpos generada tras la vacunación con CIMAvax-EGF:

La respuesta inmunitaria humoral inducida por la inmunización con la vacuna CIMAvax-EGF fue evaluada en los dos esquemas de tratamiento en estudio (QVV y VQV). En general, se observó la existencia de títulos de anticuerpos antes de inmunizar con la vacuna CIMAvax-EGF en el 100% de los pacientes evaluados, con valores iguales o mayores a 1: 500 en el 32% de ellos. Durante el primer mes de tratamiento hubo un aumento en los títulos de los anticuerpos específicos generados con ambos esquemas de tratamiento. Las particularidades de la respuesta inmune generada en cada ensayo se describen a continuación.

• Inmunidad humoral inducida por la vacuna CIMAvax-EGF en el ensayo QVV:

En este ensayo, la vacunación se administró después de la quimioterapia. La evaluación de

la inmunogenicidad se realizó determinando la respuesta de anticuerpos

específicos anti-EGF en 42 pacientes (26 del grupo vacunado y 16 del grupo control).

Como se indicó arriba, se encontró cierto nivel de títulos de anticuerpos en todos los pacientes antes de la inmunización. De ellos, en el 31% (n = 13) de los pacientes evaluados (9 en el grupo vacunado y 4 en el grupo control) el título total de anticuerpos especificado por EGF mostró valores mayores que 1: 100 (entre 1: 500 y 1: 2000). La media geométrica del inverso del título de anticuerpos específicos contra el EGF (anti-EGF) observada antes de la inmunización fue 244 para el grupo vacunado y 158 para el grupo control. La diferencia no fue estadísticamente significativa (prueba U de Mann-Whitney, p> 0.05).

Como resultado de la inmunización, los títulos de anticuerpos aumentaron. En el caso del grupo vacunado, se observó un aumento significativo después del primer mes de tratamiento, del título total de anticuerpos específicos con respecto a los valores detectados antes del inicio de la inmunización (Figura 1), según la prueba de rangos con signo de Wilcoxon (p <0.05). La diferencia en el título de anticuerpos específicos se mantuvo a lo largo del tiempo de evaluación de la respuesta, y se alcanzaron valores máximos de hasta 1: 128000 en pacientes tratados durante más de un año. Más del 70% de los pacientes vacunados (n = 19) fueron clasificados como buenos respondedores (BR), teniendo en cuenta la magnitud del anti-EGF (≥ 1: 4000) y la seroconversión alcanzada. Ninguno de los pacientes del grupo control cumplió este criterio. La diferencia en los títulos de anticuerpos detectados tras la inmunización, entre el grupo vacunado y el grupo control, fue estadísticamente significativa, según la prueba U de Mann-Whitney (p <0.01).

Figura 1. Respuesta inmune humoral anti-EGF en pacientes con NSCLC incluidos en el ensayo QVV. Los pacientes tratados con la vacuna recibieron (1 mes post-quimioterapia) inmunizaciones semanales con 50 μg de EGF durante el primer mes de tratamiento y luego mensualmente durante la fase de mantenimiento. Los pacientes del grupo control recibieron solo tratamiento paliativo después de la quimioterapia. Se tomaron muestras de sangre en los días 0, 14, 28 y mensualmente durante el tiempo de seguimiento de cada paciente. Los títulos de anticuerpos anti-EGF en suero fueron medidos por ELISA. Las placas se recubrieron con EGF humano recombinante y la reactividad de los sueros se detectó con un antisuero de cabra anti-IgG humana conjugado con fosfatasa alcalina. Se representa en escala logarítmica la media geométrica y el intervalo de confianza del 95% (95% CI) de los títulos de anticuerpos anti-EGF ensayados, en pacientes vacunados (n = 26) y controles (n = 16) en diferentes tiempos. Los asteriscos (**) indican las diferencias significativas entre ambos grupos, según la prueba U de Mann-Whitney, p0.01. La flecha indica el tiempo en que comienza el aumento significativo de los títulos frente al EGF en el grupo vacunado con respecto al día cero, según la prueba de rangos con signo de Wilcoxon, p <0.05.

La inmunización con la vacuna CIMAvax-EGF podría inducir una reactividad cruzada frente al factor de crecimiento transformante humano (TGFα), que es otra de las moléculas pertenecientes a la familia de ligandos del REGF. Esta posibilidad se evaluó tanto en el suero preinmune (día 0) como en el postinmune (PI: entre 3 y 6 meses de tratamiento) de los pacientes vacunados. Asimismo, se determinó la existencia de anticuerpos anti-TGFα antes de la inmunización.

Al igual que para el EGF, se detectó la presencia de anticuerpos naturales específicos contra el TGFα (media geométrica del inverso del título, 202) con títulos de anticuerpos entre 1: 500 y

1: 2000 en el 35% de los pacientes evaluados.

La inmunización con EGF, que aumentó los títulos de anticuerpos contra este ligando, no

inducía respuesta frente a TGFα. Tras la inmunización, los títulos de anticuerpos anti-EGF (media geométrica del inverso del título, 8724) fueron significativamente mayores que los

títulos anti-TGFα (media geométrica del inverso del título, 208), según la prueba U de Mann-Whitney (p <0.0001). No se encontraron diferencias significativas entre los niveles de respuesta frente a TGFα obtenidos antes de la vacunación y los medidos en la fase postinmunización (Figura 2).

Como resultado de estas evaluaciones podemos resumir que, utilizando el esquema de tratamiento QVV, la respuesta inmunitaria humoral específica contra EGF aumentó. Este

aumento resultó en que el 70% de los pacientes desarrollaran una buena respuesta de

anticuerpos anti-EGF. Además, la inmunización con EGF no produjo un aumento en la

respuesta frente a TGFα.

Como resultado de estas evaluaciones podemos resumir que, utilizando el esquema de tratamiento QVV, la respuesta inmunitaria humoral específica contra EGF aumentó.

Este aumento resultó en que el 70% de los pacientes desarrollaran una buena respuesta de anticuerpos anti-EGF. Además, la inmunización con EGF no produjo un aumento en la respuesta frente a TGFα.

Figura 2. Respuesta inmune humoral anti-TGFα y anti-EGF en pacientes con NSCLC incluidos en el ensayo QVV. Los pacientes fueron tratados y evaluados, como se describe en la Figura 1. Se representa en escala logarítmica la media geométrica y el 95% CI del título de anticuerpos contra cada ligando del REGF, en sueros preinmunes y postinmunes (con 3 o 6 meses de vacunación) de pacientes tratados con CIMAvax-EGF. Los asteriscos (***) indican las diferencias significativas entre los grupos, según la prueba U de Mann-Whitney con p0,0001 para la comparación entre los tiempos postinmunes (PI) y según la prueba de rangos con signo de Wilcoxon, para las comparaciones entre el Día 0 y el Post-I en cada caso.

Inmunidad humoral inducida por la vacuna CIMAvax-EGF en el ensayo VQV

En este segundo esquema de tratamiento, los pacientes recibieron cuatro veces la dosis del esquema anterior y además las dos primeras inmunizaciones se administraron antes de la quimioterapia. Las dosis se distribuyeron en cuatro sitios de inyección y se administraron con intervalos de cada 14 días antes de la quimioterapia y mensualmente, después de la quimioterapia.

En los 20 pacientes de este ensayo, en cuanto a la respuesta natural de anticuerpos anti-EGF,

se obtuvieron resultados muy similares a los encontrados en el ensayo previo. La media geométrica del inverso de los títulos fue 242.

Tras la segunda semana de tratamiento, se observó un aumento significativo en la media del inverso del título total de anticuerpos específicos con respecto a los valores detectados antes del inicio de la inmunización (Figura 3), según la prueba de rangos con signo de Wilcoxon, p <0.01. Esta diferencia se mantuvo durante todo el tiempo de evaluación de la respuesta y se alcanzaron valores máximos de títulos entre 1: 128000 y 1: 1024000 en varios pacientes (n = 6) con menos de un año de tratamiento.

Una de las observaciones más interesantes en este esquema de tratamiento fue el hecho de que durante el periodo de quimioterapia no disminuyeron significativamente los títulos de anticuerpos anti-EGF (p> 0.05, prueba de Kruskal-Wallis), pese a no recibir la vacunación (Figura 3). Tras la finalización de la quimioterapia y antes de la reanudación de las inmunizaciones mensuales, la media geométrica del inverso de los títulos de anticuerpos específicos contra el EGF fue 10642.

Figura 3. Respuesta inmune humoral anti-EGF medida en sueros de pacientes con NSCLC incluidos en los ensayos QVV y VQV. Los pacientes tratados según el esquema VQV recibieron inmunizaciones cada 14 días, con 200 μg de EGF (distribuidos en 4 sitios de inyección diferentes) durante el primer mes, luego recibieron los ciclos de quimioterapia correspondientes (4 ciclos, 1 cada 21 días) y 29 días después del fin de la quimioterapia se reanudaron las inmunizaciones, pero esta vez mensualmente. Se tomaron muestras de sangre en los días 0, 14, 28 y mensualmente durante el tiempo de seguimiento de cada paciente, y los títulos de anticuerpos anti-EGF en suero se midieron por ELISA. Las placas se recubrieron con EGF humano recombinante y la reactividad de los sueros se detectó con un antisuero de cabra contra IgG humana total conjugado con fosfatasa alcalina. El esquema de

tratamiento QVV fue descrito en la figura 1. Se representan la media geométrica y en escala logarítmica el 95% CI, de los títulos de anticuerpos anti-EGF ensayados en pacientes vacunados (n = 26) y controles (n = 16) incluidos en el estudio del esquema QVV y aquellos vacunados según el esquema VQV (n = 20) en los diferentes tiempos. La flecha indica el tiempo en que comienza el aumento significativo de los títulos de anticuerpos anti-EGF con el esquema VQV, según la prueba de rangos con signo de Wilcoxon, p <0.01.

Aplicando el esquema de tratamiento VQV, donde se introdujeron múltiples cambios con relación al esquema QVV: cambios en la dosis, la frecuencia de vacunación en la fase de inducción, cuatro sitios de administración y la combinación con quimioterapia, el 95% de los pacientes fueron clasificados como buenos respondedores (GR). Esta clasificación se alcanzó en el 80% de los pacientes con solo un mes de tratamiento (Figura 4), mientras que usando el esquema QVV se requieren dos meses para lograr esta clasificación en el mismo porcentaje de pacientes. Cuando aplicamos un criterio de clasificación de mayor magnitud de la respuesta de anticuerpos (títulos de anticuerpos iguales o superiores a 1: 64,000), el 55% de los pacientes tratados con el presente esquema fueron clasificados como súper-respondedores (SBR), mientras que con el esquema anterior solo el 15.3% de los pacientes se ajustaron a esta clasificación.

Estos resultados indican que el esquema de tratamiento puede optimizarse para lograr

respuestas de anticuerpos de mayor magnitud, en un mayor número de pacientes y en menos

tiempo de tratamiento. Asimismo, los resultados obtenidos muestran que cuando se vacuna antes de la quimioterapia, los títulos de anti-EGF no disminuyen marcadamente durante este periodo. Adicionalmente, es importante señalar que el aumento en la inmunogenicidad logrado al usar el esquema de tratamiento VQV no se asoció con un incremento de la toxicidad (datos no mostrados).

Figura 4. Porcentajes de pacientes buenos respondedores (BR) en los primeros cuatro meses de

inmunización con la vacuna CIMAvax-EGF en ambos esquemas de tratamiento, VQV y QVV. Cálculo, mensual, del porcentaje de pacientes que ha alcanzado la clasificación BR durante los 4 primeros meses de tratamiento, para ambos esquemas de tratamiento. BR: si alcanzaron títulos de anticuerpos mayores o iguales a 1: 4000 (dilución sérica) y al menos cuatro veces superiores al valor del título medido antes de la primera inmunización.

Supervivencia y toxicidad asociadas a la vacunación con CIMAvax-EGF

Supervivencia de los pacientes tratados con el esquema QVV. Influencia de la edad

Para el número total de pacientes evaluados clínicamente (n = 74) en el ensayo QVV, la supervivencia de los vacunados fue de 6.47 meses y de 5.33 meses en los pacientes no vacunados. La supervivencia alcanzó significación estadística en el subgrupo de pacientes menores de 60 años (11.57 meses vs. 5.33 meses en controles). En los pacientes del grupo control, la edad no fue un predictor de supervivencia (Neninger Vinageras et al., 2008). En la muestra de 42 pacientes escogidos para este estudio (Tabla 4), se observa la tendencia al incremento de la supervivencia como resultado de la vacunación, así como las diferencias entre las respuestas del grupo menor de 60 años y el grupo mayor de 60 años.

Tabla 4. Características demográficas de los 42 pacientes seleccionados para el

estudio del esquema QVV.

En congruencia con los resultados observados en la muestra total de pacientes evaluados clínicamente en el ensayo QVV, la supervivencia (mediana, 13 meses) de los pacientes vacunados menores de 60 años (n = 17) fue mayor (mediana: 7.03 meses) que la de los pacientes control (n = 12) del mismo grupo etario (figura 20a) en el grupo de 42 pacientes seleccionados para los estudios de la respuesta inmune específica. De la misma manera, se observó dentro del grupo de pacientes vacunados (Figura 20b), donde el subgrupo de pacientes menores de 60 años presentó una supervivencia significativamente mayor que la de los pacientes tratados mayores de 60 años (n = 9, mediana: 7.43 meses). Por tanto, podemos decir que, aunque con valores algo superiores en las medianas de supervivencia, los pacientes seleccionados para el estudio inmunológico constituyen una muestra representativa de lo observado en la muestra total de pacientes incluidos en el ensayo QVV, en términos de supervivencia global.

Figura 20. Funciones de supervivencia en pacientes escogidos para el estudio inmunológico del

ensayo QVV. a) Curvas de Kaplan-Meier que muestran la supervivencia de los vacunados y los controles en el grupo de pacientes menores de 60 años. b) Se muestra la supervivencia del grupo vacunado según los grupos de edad (log-rank, p <0.05).

Esta influencia de la edad en la respuesta a la vacunación fue independiente de los niveles de respuesta de los anticuerpos anti-EGF, dado que los títulos de anticuerpos obtenidos por la vacunación no fueron significativamente diferentes entre los dos grupos de edad y la proporción de buenos y malos respondedores fue similar en ambos grupos etarios. De hecho, la influencia de la edad en la supervivencia de los pacientes tratados con el esquema terapéutico QVV,

se hizo evidente incluso dentro del grupo de buenos respondedores (BR) a la vacunación (Tabla 5). Los pacientes con buena respuesta de anticuerpos anti-EGF, producto de la vacunación con

CIMAvax-EGF, y menores de 61 años, mostraron un tiempo de supervivencia superior al de los pacientes mayores de 60 años.

La edad no se correlacionó con el efecto biológico de los anticuerpos en su función de neutralizar el EGF y prevenir su unión con el receptor REGF.

Tabla 5. Relación de la respuesta inmune y la edad con la supervivencia de los pacientes

vacunados según el esquema QVV.

Sin embargo, se encontró una correlación inversa entre la edad y los valores de concentración de

TGFα, medido en el suero inmunológico de los pacientes vacunados. Los pacientes de 60 años o menos que recibieron la vacunación presentaron un aumento en las concentraciones de TGFα en el suero inmunológico (Figura 21). Queda por demostrar si esto depende de la edad o de la vacunación, ya que el grupo control evaluado no contó con muestra suficiente para abordar este tipo de análisis.

En resumen, la vacunación con CIMAvax-EGF produjo una ventaja de supervivencia en

los pacientes menores de 60 años del ensayo QVV. En este subgrupo de pacientes, tras la vacunación los niveles de TGFα fueron más altos que los encontrados en los mayores de 60 años.

Supervivencia de pacientes tratados con el esquema VQV.

En el ensayo VQV se evaluaron 20 pacientes con NSCLC avanzado. En el momento del diagnóstico, el 50% de los pacientes estaba en estadio IV y el otro 50% en estadio IIIB de

la enfermedad (Tabla 6). Todos los pacientes recibieron dos dosis (200μg) de la vacuna CIMAvax-EGF antes de la primera línea de quimioterapia y al menos una dosis después de haber finalizado la quimioterapia.

El análisis de la respuesta al tratamiento de los 20 pacientes incluidos en este ensayo resultó en un control de la enfermedad del 85%, ya que se obtuvieron dos respuestas completas (RC), cinco respuestas parciales (RP) y estabilización de la enfermedad en 10 pacientes (EE). Al estudiar la supervivencia, la mediana para los 20 pacientes fue de 12.8 meses. En el subgrupo de 17 pacientes en los que se alcanzó alguna respuesta objetiva (RC o RP) o al menos EE, la mediana de supervivencia fue de 16.2 meses. Cuando la supervivencia se estimó desde el primer mes después del final de la primera línea de quimioterapia (momento que corresponde a la medición de la supervivencia cuando se utilizó el esquema de tratamiento QVV),

se obtuvo una mediana de supervivencia de 9.3 meses. Este valor fue superior a la supervivencia

lograda en pacientes vacunados según el esquema QVV (mediana: 6.47 meses), y cuando se comparó con el grupo control de ese ensayo (mediana: 5.33 meses), fue significativamente mayor (log-rank, p <0.05) (datos no mostrados).

En ambos esquemas de tratamiento la vacuna fue segura y bien tolerada.

Los efectos adversos más comunes observados fueron: escalofríos, fiebre, náuseas, vómitos y fatiga; todos clasificados como grado 1 o 2 (leves o moderados) según los Criterios de Toxicidad Comunes del National Cancer Institute. No se observó ningún efecto adverso de grado 3 o 4 relacionado con el tratamiento. En el caso del ensayo QVV, no se observaron diferencias entre los parámetros hematológicos y los parámetros bioquímicos sanguíneos del grupo control y los vacunados (datos no mostrados).

Relación entre la respuesta inmune específica y la supervivencia en pacientes con CPCNP inmunizados con CIMAvax-EGF

Relación entre las características de la respuesta inmune específica y la

supervivencia de pacientes con NSCLC tratados con el esquema QVV:

Dentro del grupo de pacientes vacunados en el ensayo QVV, los pacientes con buena respuesta

de anticuerpos (BR; n = 19) posratamiento, mostraron una supervivencia significativamente mayor (mediana: 11.7 meses) que el grupo de malos respondedores (MR, n = 7) al tratamiento

(Figura 22a), hallazgo previamente descrito para este tipo de vacunación (González et al.

2003).

La supervivencia también se asoció con la reducción producida por la vacuna en las concentraciones séricas de EGF. El 85% de los pacientes clasificados como BR lograron reducir las concentraciones de EGF por debajo de 168 pg/mL. En aquellos pacientes (n = 17) en los que la concentración de EGF se redujo a valores inferiores a 168 pg/mL, los tiempos de supervivencia fueron significativamente mayores (mediana: 13 meses) que en los pacientes (n = 9) donde no se consiguió una reducción por debajo de este valor (mediana: 5.6 meses; test de log-rank, p = 0.0023) (Figura 22b).

Con la medición del Factor de Crecimiento Transformante (TGFα) se obtuvo un resultado distinto. Cuando se estudió la supervivencia asociada a los niveles de TGFα postinmunización (Figura 22c), se observaron tiempos de supervivencia significativamente más largos en aquellos

pacientes (n = 6) que mostraron concentraciones más altas de TGFα (mediana: 33.5 vs. 8.47

meses).

Figura 22. Curvas de supervivencia relacionadas con las características de la respuesta inmune

humoral frente al EGF humano en pacientes con NSCLC tratados según el

esquema QVV).

1. a) Supervivencia en función de la magnitud de la respuesta de anticuerpos anti-EGF (log-rank, p = 0.001).
2. b) Supervivencia de los pacientes vacunados que reducen las concentraciones de EGF a valores inferiores a 168 pg / mL frente a aquellos que no las reducen hasta esos niveles con el tratamiento (Log rank p = 0.0023).
3. c) muestra la supervivencia de los pacientes vacunados según la concentración de TGFα en suero inmune (Log rank; p = 0.0073).
4. d) Supervivencia de los pacientes vacunados según la capacidad de los sueros inmunes para inhibir la unión EGF / REGF (Log rank; p = 0.0001). e) Supervivencia de los pacientes vacunados según el reconocimiento del epítopo inmunodominante (B loop) de la molécula de EGF (Log rank, p = 0.012).

Los pacientes (n = 10) cuyo suero inmune fue capaz de inhibir la unión entre EGF y su receptor mostraron tiempos de supervivencia más largos que aquellos pacientes en los que se observó inhibición tras la inmunización (mediana: 11.7 vs. 5.63 meses, prueba Log rank, p = 0.0001; Figura 22d). En el caso de la inmunodominancia del B-loop de la molécula de EGF, los pacientes (n = 6) en los que la respuesta de anticuerpos generada fue preferentemente contra el bucle central (B loop) de la molécula de EGF alcanzaron tiempos de supervivencia más prolongados (mediana: 33.5 meses), mientras que en aquellos en los que una inmunodominancia del B-loop de la

molécula, la supervivencia mediana fue de 7.43 meses (prueba Log rank, p = 0.012;

22e). Todas estas asociaciones se observaron en los pacientes vacunados pero no en los pacientes del grupo control.

Relación entre las características de la respuesta inmune específica y la

Supervivencia de pacientes con NSCLC tratados con el esquema VQV.

En el esquema VQV optimizado también se verificó que existe una mayor supervivencia en los pacientes con mejor respuesta de anticuerpos. En correspondencia con los resultados de los

ensayos clínicos realizados anteriormente, cuando se observó la influencia de la magnitud de la respuesta de anticuerpos en la supervivencia de los pacientes tratados, se registraron tiempos de supervivencia en pacientes que mostraron títulos anti-EGF muy altos (SBR). Los pacientes SBR (n = 14) mostraron una supervivencia significativamente mayor (Figura 23) (mediana: 19.3 meses) que los BR (mediana: 8.4 meses) según la prueba Log rank (p = 0.0036).

Para el resto de los parámetros inmunológicos evaluados, no se encontró relación con la supervivencia, dado que todos los pacientes escogidos para estas determinaciones eran SBR y ambos tenían características similares en términos de la respuesta inmune específica

desarrollada tras la vacunación y los tiempos de supervivencia. Además, en este ensayo se observó que los pacientes que presentaban una alta concentración de EGF sérico antes de iniciar la vacunación posteriormente tuvieron una mejor supervivencia, y esta diferencia fue estadísticamente significativa según la prueba Log rank (p = 0.015). La misma tendencia se observó en los pacientes del esquema QVV, pero en este caso no se alcanzó significación estadística.